一种可降解生物胺的多铜氧化酶重组酶制造技术

本发明专利技术公开了一种可降解生物胺的多铜氧化酶重组酶，属于发酵技术领域。该方法是在酱油加入适量多铜氧化酶重组酶，该酶由副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)中的多铜氧化酶基因在大肠杆菌中异源表达产生，多铜氧化酶重组酶分解生物胺为醛和氨，从而达到降低生物胺的目的。该酶具有较强的降解生物胺的性能，在24h内能够降解色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺，精胺、亚精胺，降解效率最高可达75％。 1

【技术实现步骤摘要】
一种可降解生物胺的多铜氧化酶重组酶
本专利技术涉及一种可降解生物胺的多铜氧化酶重组酶，属于发酵

技术介绍
酱油是我国及东南亚各国特有的调味品，以大豆、小麦或麸皮等为原料，利用米曲霉、酵母菌、乳酸菌等微生物，通过发酵作用酿成具有特殊色、香、味的液体调味品。酱油中含有丰富的蛋白质，大量的游离氨基酸，游离的氨基酸在氨基酸脱羧酶的作用下会生成生物胺。生物胺是一类具有生物活性的小分子量含氮有机物的总称，是生物体内正常的生理活性物质，微量生物胺在机体细胞活动中发挥着重要作用，当人体摄入过量的生物胺尤其是同时摄入多种生物胺时，会引起诸如头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重的还会危及生命。目前主要从三个方面控制食品中的生物胺，1、从源头控制：控制游离氨基酸的含量，局限性在于会影响某些高蛋白食品的风味；采用无氨基酸脱羧酶活性的菌株代替原生产菌种，局限性在于仅适用于封闭的单菌发酵体系。2、过程控制：通过对生产过程中的原料、温度和盐度进行合理选择，抑制生物胺产生菌的生长，以达到抑制生物胺产生的目的，局限性在于加工温度和盐度等因素多由食物特性决定，而低温贮藏会提高设备和能耗费用，且有些微生物低温下也能产生生物胺；添加降解生物胺的菌株，局限性在于人们担心添加菌株的安全性以及可能会影响食物风味。3、末端消除：通过向发酵食品中添加生物胺降解酶，不损害食品营养，不产生新的毒性物质，局限性在于现有生物胺降解酶降解效果差，降解类型少，最适pH偏酸性，不适用酱油等酸性发酵食品。目前，利用生物胺降解酶降低酱油中的生物胺主要有三个方面的难点：第一，酱油中的环境偏酸性，添加进酱油的生物胺降解酶需要具有耐酸特性；第二、酱油中的环境是高盐环境，添加进酱油的生物胺降解酶需要具有耐盐特性；第三，酱油中生物胺种类多，添加进酱油的生物胺降解酶若专一降某种生物胺，则无法满足酱油中应用的需要。鉴于以上背景，急需找到一种降解效果好，最适pH偏酸性的生物胺降解酶来降低酱油中生物胺的含量。多铜氧化酶是一类可通过其光谱学性质，同源性的序列及与底物的反应机理定义的一类含铜氧化酶家族，它将生物胺催化氧化成对应的醛、氨和水，达到降低生物胺含量的目的。由于野生酶无法满足应用的需求，因此，采用基因工程的手段提高酱油中生物胺的降解效率显得十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可降解生物胺的多铜氧化酶重组酶，用多铜氧化酶降解生物胺的方法来降低生物胺，从而提供一种降低发酵食品中生物胺的方法。本专利技术的第一个目的是提供一种基因工程菌，以大肠杆菌为宿主，表达SEQIDNO.2所示的多铜氧化酶。在本专利技术的一种实施方式中，以大肠杆菌BL21为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，以pET系列质粒为表达载体。本专利技术的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是将SEQIDNO.1所示的基因序列与载体连接，转化至大肠杆菌细胞中。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体为pET28a。本专利技术的第三个目的是提供一种多铜氧化酶的生产方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至培养基中，于35～37℃培养30～48h，收集菌体细胞，破碎细胞获得酶液。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法将所述基因工程菌接种至LB培养基中，培养至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG诱导。本专利技术的第四个目的是提供所述基因工程菌在食品领域降低生物胺方面的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括降低发酵食品中的生物胺含量。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用是将所述基因工程菌生产的多铜氧化酶添加至酱油中，降解酱油中的生物胺。在本专利技术的一种实施方式中，所述生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺中的至少一种。有益效果：本专利技术提供的多铜氧化酶重组酶具有较强的降解生物胺的性能，降解谱广，能够在24h内降解色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺，精胺、亚精胺，降解率达2％～75％，较野生菌株中的多铜氧化酶酶活提高10～15倍，并且该重组酶耐酸，耐高盐，对色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺这几种食品中常见的生物胺具有较明显的降解作用，有助于使发酵食品的安全性得到进一步提高。附图说明图1为(副干酪乳杆菌)(Lactobacillusparacasei)中多铜氧化酶基因的验证图；其中，MMarker；1阴性对照；2-3Lactobacillusparacasei中多铜氧化酶基因；图2为不同pH下的多铜氧化酶酶活；图3为不同盐浓度下的多铜氧化酶酶活。具体实施方式生物胺采用HPLC法进行检测，检测方法参考李志军《食品中生物胺及其产生菌株检测方法研究》。生物胺降解率＝(初始浓度一终浓度)/初始浓度。实施例1根据NCBI中的LactobacillusparacaseistrainL9(GenBank登录号为:CP012148.1)中的多铜氧化酶的基因序列，设计引物，以本研究室保藏的副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)基因组为模板，扩增多铜氧化酶基因。扩增所需的引物如下：上游：ATGAAAACCTATACGGACTATTTC下游：TTACATTTTCATCCCCATTTPCR反应程序：95℃下先预变性3min，然后进行以下循环：95℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min30s；34个循环后，72℃下延伸10min，4℃下保温。以Lactobacillusparacasei的基因组为模板，PCR扩增，扩增结束后由1％琼脂糖凝胶电泳显示扩增结果，如图1所示有1500bp左右的条带，与目的条带大小一致，表明Lactobacillusparacasei(副干酪乳杆菌)中含有多铜氧化酶基因，将PCR产物纯化测序，测序结果如SEQIDNO.1所示。实施例21、获得目的片段：以Lactobacillusparacasei的基因组为模板，PCR扩增结束后由1％琼脂糖凝胶电泳显示扩增结果，有1500bp左右的目的条带。用DNA胶回收试剂盒将PCR产物纯化，得到目的片段。2、获得载体：将含有质粒pET-28a的大肠杆菌划线到含卡那霉素的LB平板上，培养12h后，挑单菌落到20mL/250mL摇瓶LB培养基中(含卡那霉素)，37℃下200r·min-1过夜培养，使用质粒提取试剂盒提质粒。3、酶切连接：根据基因和载体的序列选择合适的限制性内切酶EcoRI、HindIII，37℃金属浴中反应45min。表150μL限制性内切酶酶切反应体系酶切后的基因片段和质粒经过回收纯化后，按摩尔比4～10：1的比例混合，通过SolutionI连接酶进行连接反应，于16℃金属浴中连接过夜。4、转化：将感受态细胞大肠杆菌JM109(克隆宿主)加入5μL连接产物，均匀混合后于冰中静置30min。42℃水浴90s后立即取出于冰中放置2-5min。加入700μLLB培养基摇床(37℃，200r·min-1)振荡培养1h。4000r·min-1离心2min，弃去大部分上清液，留100μL左右上清液重悬菌体。菌液均匀涂布于含有卡那霉素的平板，置于37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单菌落，通过菌落PCR筛选阳性转化子。5、筛选出含重组质粒的转化菌落，提质粒，酶切验证。6、选2～3个酶切验证结果正确的重组质粒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO.2所示的多铜氧

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达SEQIDNO.2所示的多铜氧化酶。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为表达载体。3.构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，将SEQIDNO.1所示的基因序列与载体连接，转化至大肠杆菌细胞中。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体为pET28a。5.一种多铜氧化酶的生产方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的基因工程菌接种至培养基中，于35～37℃培养30～48h，收集菌体细胞，破碎细胞获...

【专利技术属性】
技术研发人员：方芳，徐洁，周景文，李巧玉，陈坚，曾伟主，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32