本发明专利技术公开了一种在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶的方法，属于基因工程及发酵工程领域。本发明专利技术通过检索信号肽序列，用Bacillus subtilis 168基因组PCR出各信号肽，与目的基因麦芽糖淀粉酶及载体pHY300PLK进行重组构建，并转化至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CCTCC M 2016536，得到三株重组枯草芽孢杆菌。以重组枯草芽孢杆菌为菌种，发酵生产麦芽糖淀粉酶。并通过确定氮源、碳源、发酵条件等优化最佳摇瓶条件，提高重组酶酶活。本发明专利技术的优点在于确定了在枯草芽孢杆菌中能高效表达麦芽糖淀粉酶的信号肽，并用食品安全的枯草芽孢杆菌为表达宿主重组表达麦芽糖淀粉酶，对重组菌产酶进行了发酵优化，表达量较好，得到的发酵上清液酶活为396U/mL，并且发酵原料来源广泛，生产成本较低。
【技术实现步骤摘要】
一种在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶的方法
本专利技术涉及一种在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶的方法，属于基因工程及发酵工程领域。
技术介绍
麦芽糖淀粉酶(maltogenicamylase或maltogenase，EC3.2.1.133)，可以催化麦芽三糖、淀粉和糊精中(1→4)-β-D-糖苷键的水解，除去麦芽糖残基，通常在外部随机水解，但是它也可进行内部水解。除了水解作用外，麦芽糖淀粉酶还催化转糖基作用的进行，隶属于糖苷水解酶13家族，其来源众多，包括地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜热放线菌(Thermusvulgaris)等，麦芽糖淀粉酶在淀粉糖化工业、食品烘焙、面粉工业中的应用广泛。麦芽糖淀粉酶可以水解淀粉生成麦芽糖和部分糊精，延长烘焙食品的货架期，减少食品的浪费。目前以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的麦芽糖淀粉酶最主要应用于麦芽糖浆制备和抗面包老化，因此本专利麦芽糖淀粉酶取自嗜热脂肪芽孢杆菌。目前有很多文献研究了麦芽糖淀粉酶在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中异源表达情况，在大肠杆菌中的表达比在枯草芽孢杆菌中的要好，但因为大肠杆菌在进行生长产酶的过程中会产生内毒素等，是一种致病菌，会对人体不利，限制了其应用。而枯草芽孢杆菌其细胞壁不含内毒素，是一种非致病的土壤微生物，已被美国食品药物管理局和中国相关部门认定为食品安全级菌株GRAS(Generallyrecognizedassafe)。但是目前在枯草芽孢杆菌中表达的麦芽糖淀粉酶普遍酶活较低。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌重组菌，所述重组菌是以核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的序列为信号肽，异源表达了麦芽糖淀粉酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述麦芽糖淀粉酶的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌是以枯草芽孢杆菌CCTCCM2016536为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌是以pHY300PLK作为表达载体。本专利技术的第二个目的是提供所述的枯草芽孢杆菌重组菌的构建方法，所述方法具体是：以Bacillussubtilis168基因组为模板PCR出核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的信号肽，将信号肽与麦芽糖淀粉酶基因与表达载体pHY300PLK进行重组构建，并转化至枯草芽孢杆菌CCTCCM2016536中得到重组菌。本专利技术的第三个目的是提供所述的枯草芽孢杆菌重组菌的发酵方法，所述方法具体为：将枯草芽孢杆菌重组菌接种于LB培养基中，在35～38℃、180～220rpm下培养8-10h后以5～10％接种量转接至TB发酵培养基中培养。在本专利技术的一种实施方式中，所述LB培养基为：蛋白胨8～12g/L，酵母粉4～6g/L，氯化钠8～12g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述TB发酵培养基为：酵母浸膏20～25g/L，大豆蛋白胨5～10g/L，甘油4～6g/L初始pH6～7。在本专利技术的一种实施方式中，所述TB培养基中培养条件为：培养温度为40～41℃，180～220rpm培养45～50h。本专利技术的第四个目的是提供所述重组菌在淀粉糖化工业、食品烘焙、面粉工业中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术确定了在枯草芽孢杆菌中能高效表达麦芽糖淀粉酶的信号肽，并用食品安全的枯草芽孢杆菌为表达宿主重组表达麦芽糖淀粉酶，对重组菌产酶进行了发酵优化，表达量较好，得到的发酵上清液酶活为396U/mL，并且发酵原料来源广泛，生产成本较低。附图说明图1重组质粒YvcE-amyM-pHY300PLK构建流程图；图2YvcE-amyM-pHY300PLK、LipA-amyM-pHY300PLK、YncM-amyM-pHY300PLK重组质粒PCR验证图；图3YvcE-amyM-pHY300PLK重组菌摇瓶发酵SDS-PAGE电泳图。具体实施方式实施例1：重组载体构建信号肽YvcE、LipA、YncM与连有麦芽糖淀粉酶的表达载体进行重组构建设计含有同源臂的引物YvcE-F、YvcE-R(SEQIDNO.5、SEQIDNO.6)，以Bacillussubtilis168基因组为模板将YvcE信号肽扩增出，划线部分为同源臂区域。LipA与YncM信号肽的重组构建同上，引物分别为LipA-F、LipA-R(SEQIDNO.7、SEQIDNO.8)及YncM-F、YncM-R(SEQIDNO.9、SEQIDNO.10)。设计引物P-F、P-R(SEQIDNO.11、SEQIDNO.12)，以amyM-pHY300PLK载体质粒为模板扩增出表达载体序列。YvcE-F：5’-TAAGGAGTGTCAAGAATGAGAAAGAGTTTAATTACACTTGGT-3’YvcE-R：5’-GCTTGCAGAAGAAGACGCCGATGCAGTTTTACTTGTAAA-3’LipA-F：5’-TAAGGAGTGTCAAGAATGAAATTTGTAAAAAGAAGGATCAT-3’LipA-R：5’-GCTTGCAGAAGAAGAAGCGGCTTTTGCTGACGGCTGCAA-3’YncM-F：5’-TAAGGAGTGTCAAGAATGGCGAAACCACTATCAAA-3’YncM-R：5’-GCTTGCAGAAGAAGAAGCGTCTGCCGCGGGTAAACCTG-3’P-F：5’-TCTTCTTCTGCAAGCGTTAAAGG-3’P-R：5’-TCTTGACACTCCTTATTTGATTTTT-3’PCR体系为：20μMY-F/P-F和Y-R/P-R各0.5μL，dNTPMix4μL，5×PSBuffer10μL，2.5U/μL的PrimeStar聚合酶0.5uL，模板0.5μL/单菌落，加双蒸水补齐50μL。PCR条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸2min20s/6min，30个循环，PCR产物进行胶回收。将扩增出且已回收的两端片段根据HDCloningKit试剂盒要求按照插入片段和载体的摩尔比例为2:1进行混合，应用下面连接体系进行连接后将连接产物转入E.coliJM109感受态细胞。转化感受态细胞后培养涂布LB固体平板(含100ug/mL氨苄抗生素)，37℃培养过夜。待平板上长出单菌落，挑单菌落于LB液体培养基中培养8-10h后抽提质粒，因信号肽序列较小，因此设计引物下游引物amyM-R(SEQIDNO.13)PCR信号肽与目的基因进行验证，大小正确后对重组质粒测定DNA序列，阳性克隆子即含有重组质粒。amyM-R：5’-TTAGTTCTGCCAAGTCACAGTAAT-3’实施例2：重组质粒的转化1)新鲜LB平板(LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5，NaCl10g/L，0.2g/L琼脂粉)挑枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis(CCTCCM2016536)单菌落接种于5mlLB液体培养基中，37℃，200rpm培养10.5h。2)取2.5mL转接入40mL加0.5M的山梨醇LB培养基，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌是以核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列为信号肽，异源表达了麦芽糖淀粉酶。
【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌重组菌，其特征在于，所述重组菌是以核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的序列为信号肽，异源表达了麦芽糖淀粉酶。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述麦芽糖淀粉酶的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求1所示的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以枯草芽孢杆菌CCTCCM2016536为宿主。4.根据权利要求1所示的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以pHY300PLK作为表达载体。5.构建权利要求1所述的枯草芽孢杆菌重组菌的方法，其特征在于，所述方法具体是：以Bacillussubtilis168基因组为模板PCR出核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的信号肽，将信号肽与麦芽糖淀粉酶基因与表达载体pHY300PLK进行重组构建，并转...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，宿玲恰，李雨桐，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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