本发明专利技术提供了一种保藏号为CGMCCNo.11750的枯草芽孢杆菌(Busillus subtilis)，以及含有此枯草芽孢杆菌的微生物菌剂，还提供了所述枯草芽孢杆菌或微生物菌剂在防治番茄、黄瓜、草莓等果蔬灰霉病中的应用，本发明专利技术提供的保藏号为CGMCCNo.11750的枯草芽孢杆菌及含有该菌的微生物菌剂对灰霉病菌有很强的拮抗作用，且见效快，防效持续时间长。利用本发明专利技术筛选出的枯草芽孢杆菌菌株可以制成相应的微生物制剂，将制得的微生物菌剂施用到田间后，通过该枯草芽孢杆菌的作用能够防治番茄、黄瓜、草莓等蔬菜灰霉病的发生，从而降低果蔬生产过程中化学农药的施用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种枯草芽孢杆菌J-5及其生物菌剂和应用。
技术介绍
灰霉菌（Botrytis cinerea），又称灰葡萄孢菌，是一类世界性分布的真菌，它是一种广寄主性的、能够引起200多种已知植物（如水果、蔬菜及花卉）灰霉病的坏死营养型病原真菌。以菌核、分生孢子及菌丝体随病残组织在土壤中越冬，通过伤口、自然孔口及幼嫩组织侵入寄主，发病后又可产生大量分生孢子，借风雨传播蔓延进行多次再侵染，引起灰霉病，花、果、叶、茎均可发病，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最艰难的重要病害之一。在黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓等上，灰霉病病苗色浅，叶片、叶柄发病呈灰白色，水渍状，组织软化至腐烂，高湿时表面生有灰霉。幼茎多在叶柄基部初生不规则水浸斑，很快变软腐烂，缢缩或折倒，最后病苗腐烂枯萎病死。果实染病，青果受害重，残留的柱头或花瓣多先被侵染，后向果实扩展，致使果皮呈灰白色，并生有厚厚的灰色霉层，呈水腐状，叶片发病从叶尖开始，沿叶脉间成“V”形向内扩展，灰褐色，边有深浅相间的纹状线，病键交界分明。染病地块轻则减产20%，严重的减产50%以上。目前灰霉病已成为黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓生产上的一种主要病害，对黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓产量和品质构成了极为严重的威胁，该病目前主要通过杀菌剂类化学农药进行防治，但是效果不佳且对环境污染较为严重，急需寻找低污染、高防效的灰霉病防治方式。利用拮抗微生物防治农作物病害由于具有低污染、低残留、不引起病害抗性等优点，近年来得到广泛的重视。该防治方式的关键是筛选出对病原微生物有拮抗作用且抑菌谱广的拮抗微生物，并利用菌剂或者其代谢产物粗提取物形成生物制剂，在黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓的灰霉病防治上进行应用。目前已有一些用于灰霉病生物防治的生防制剂，但大多抑菌效果不够理想，抑菌谱窄，且作用持续时间短。因此，迫切需要筛选出一种能够高效、持久拮抗灰霉病病源菌的微生物菌株及相关的微生物菌剂，从而通过生物防治降低灰霉病给黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓生产带来的危害。
技术实现思路
基于以上技术现状，本专利技术的目的在于提供一种能够有效、持久抑制灰霉菌生长，尤其是能够高效拮抗黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病的枯草芽孢杆菌菌株，并且本专利技术还提供了一种含有上述枯草芽孢杆菌菌株的用于防治灰霉菌感染所致的黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病的生物菌剂。为了达到上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案如下：本专利技术所述的枯草芽孢杆菌J-5于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 11750。本专利技术还提供了含有所述枯草芽孢杆菌J-5的生物菌剂，其中枯草芽孢杆菌J-5的含量为4×109cfu/g~7×109cfu/g菌剂。所述生物菌剂为枯草芽孢杆菌J-5的芽孢菌剂的混合菌剂。本专利技术还提供了所述枯草芽孢杆菌J-5及其菌剂在防治黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓等果蔬灰霉病中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术的枯草芽孢杆菌J-5可以有效抑制灰霉菌感染所致的黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病，具有高效的防治作用，有效率可以达到60%以上，且见效快，作用持续时间长。作为生物介入手段，可以避免化学品如农药引起的残留和污染，是一种更经济、环保、绿色的植物病害防治手段。本专利技术的枯草芽孢杆菌J-5可以制成多种生物菌剂，或作为有效成分添加到现有生物菌剂中，当制成芽孢菌剂时，可适应多种保存环境，并具有较长的保质期，在常温常压下，可保存1-3年，利于仓储和运输。生物样品保藏信息枯草芽孢杆菌J-5，分类命名为Bacillus subtilis，已于2015年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC No. 11750。附图说明图1为枯草芽孢杆菌J-5在固体LB培养基上培养48小时的菌落形态。图2为枯草芽孢杆菌J-5复红染色后的光学显微镜下的形态。具体实施方式实施例1 对黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓灰霉病具有拮抗作用的细菌的分离、筛选采集灰霉病害发病严重黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓地块中的健康植株根际土壤作为试验材料，在实验室内从该样品中进行细菌分离，在LB培养基上进行多次分离纯化，得到纯培养菌落后，以番茄灰霉病菌为指示菌，采用对峙试验方法进行拮抗性能高的菌株的筛选。具体步骤：上述土壤样品来自河北省、宁夏、山东、山西等地的染有灰霉病害的黄瓜、番茄、茄、甜椒、草莓种植田地中，将该土壤经梯度稀释后涂布于PB培养基中，于28℃恒温培养箱培养。上述培养基根据“微生物培养基手册”的记载制备得到，培养基配方为：牛肉膏5g ，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15g，自来水1000ml，pH7.2~7.4，121℃灭菌20min后使用。待平板长出菌落后，挑取不同形态的单菌落采用划线分离法反复进行分离纯化，直到得到单菌落的纯培养物，纯化后的菌株保存于PB培养基斜面。以番茄灰霉菌为指示菌，采用十字交叉法测定不同菌株对灰霉菌生长的抑制率。将筛选出的细菌菌株点接在距平板中央3cm 处的4个角上，平板中央同时接种直径5mm 的活化的番茄灰霉病菌块，每个菌株重复三次，28℃恒温培养5d，测量、记录抑菌圈直径的大小并计算平均抑制率。筛选出了对番茄灰霉菌拮抗作用最强的菌株J-5。并对该菌株进行了保藏，保藏号为CGMCC No.11750。实施例2 拮抗菌株遗传稳定性的确定将菌株J-5在PB培养基上采用划线法进行传代培养，培养20代后，采用平板对峙法测定传代后的J-5菌株对番茄灰霉菌的拮抗效果，以原始J-5菌株为对照，该拮抗菌株经过20代培养后与原始菌株具有相同的拮抗作用，说明该拮抗菌株具有良好的遗传稳定性，将抑菌效果稳定的拮抗菌进行PB培养基液体培养，吸取菌液进行-80℃甘油保存。实施例3 拮抗菌株的鉴定 根据《常见细菌系统鉴定手册》中记载的实验内容和实验方法，对筛得的保藏号为CGMCC No.11750的菌株J-5进行鉴定，菌落形态观测是在PB培养基上进行的，将菌株划线接种后，于28℃恒温培养24 小时观察菌落形态。保藏号为CGMCC No.11750的菌株的菌落近圆形，边缘啮蚀状，脐突状突起，表面皱褶，颜色为乳白色，无光泽不透明，与培养基结合不紧密。挑取培养24 小时菌苔革兰氏染色后在光学显微镜的100倍油镜下观察。在显微镜下可以看到，保藏号为CGMCC No.11750的菌株为芽孢杆菌，革兰氏阳性菌，芽孢位置中生或近中生，芽孢膨大，无伴孢晶体，单个出现。初步确定为芽孢杆菌。 16SrDNA鉴定：将保藏号为CGMCC No.11750的菌株接种到PB培养液，28℃摇床培养24 h，采用天根生化科技（北京）有限公司基因组DNA提取试剂盒提取该菌株的基因组DNA，然后以提取的总DNA 作为模板，以上游引物：F27（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′）和下游引物R1492 (5′- TACGGCTA CCTTGTTA CGAC TT -3 ′)引物对进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μl，反应体系为:基因组DNA 1μL，10×本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌J‑5，该枯草芽孢杆菌于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 11750。
【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌J-5，该枯草芽孢杆菌于2015年11月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 11750。2.含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌J-5的生物菌剂，其特征在于：其中每克菌剂中枯草芽孢杆菌J-5的含量为4×109cfu/g~7×109cfu。3.根据权利要求2所述的生物菌剂，...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾振华，金伟伟，黄亚丽，宋水山，马宏，宋聪，张立文，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13
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