一种利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用重组微生物发酵生产1,3‑丙二醇的方法。本发明专利技术首先提供一种重组微生物，该微生物能够过表达乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和accDA、表达丙二酰辅酶A合成酶基因mcr、表达3‑羟基丙酰辅酶A合成酶基因pcs、3‑羟基丙酰辅酶A还原酶基因pduP和1,3‑丙二醇还原酶基因yqhD。将该重组微生物在摇瓶或者发酵罐中以葡萄糖为底物进行发酵培养获得1,3‑丙二醇。本发明专利技术的重组微生物在发酵过程中可以利用廉价的葡萄糖，蔗糖，糖蜜，木糖等为原料且无需添加昂贵的辅酶B12，因此可以显著降低生产成本，具有良好的市场应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法
本专利技术属于基因工程和生物发酵
，具体地说，本专利技术涉及无需添加辅酶维生素B12、通过单一重组微生物将可发酵糖高效生物转化为1,3-丙二醇的方法。
技术介绍
1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，其最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯二甲酸聚合生成聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT与PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PBT(聚对苯二甲酸丁二醇酯)相比具有更优良的性能，例如更好的耐污染性、韧性和回弹性以及抗紫外性能等，此外还具有耐磨、吸水性低、低静电等优点。因此PTT被认为是PET的升级产品，具有广阔的市场前景。目前，1，3-丙二醇的生产方法主要包括化学法和生物法。化学法通常是以环氧丙烷或者丙烯为原料通过复杂的催化过程合成1，3-丙二醇。化学合成法的缺点是副产物多，选择性差，操作条件需高温高压，设备投资巨大，原料为不可再生资源。因此，化学法生产1，3-丙二醇的工艺技术路线目前基本已经淘汰。生物法生产1，3-丙二醇目前主要包含两条技术路线：一、以甘油为原料利用天然微生物生产1，3-丙二醇；二、以葡萄糖为原料利用重组微生物生产1，3-丙二醇。具体介绍如下。一种是以甘油为原料利用天然微生物生产1，3-丙二醇，如克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)、丁酸梭状芽胞杆菌(Clostridiumbutyricum)及弗氏柠檬酸菌(Citrobacterfreundii)可以在厌氧或者微氧的条件下将甘油转化为1，3-丙二醇。这个工艺路线的主要缺点是：1、常用的1,3-丙二醇生产菌株克雷伯氏肺炎杆菌为条件致病菌，其生产过程中生物安全性需要严格控制；2、大量副产物如乙酸、乳酸，丁二酸，2，3-丁二醇的合成，使得整个后提取过程变得十分复杂；3、甘油价格受到市场的波动较大。现有技术中还有一种是以葡萄糖为原料利用重组微生物生产1，3-丙二醇的方法，如杜邦公司通过在大肠杆菌中外源表达来自酿酒酵母的甘油合成途径(甘油3-磷酸脱氢酶及甘油3-磷酸甘油脂酶)和来自克雷伯氏肺炎杆菌的甘油脱水酶及其激活因子并利用大肠杆菌自身的NADPH依赖的醇脱氢酶YqhD，实现了从葡萄糖到1，3-丙二醇的一步转化(CN200380104657.2)。这一工艺路线的缺点是甘油脱水酶是一种需要辅酶B12为辅因子的酶，而大肠杆菌无法合成辅酶B12，因此在发酵过程中需要添加昂贵的辅酶B12，极大提高了1,3-丙二醇的生产成本，不利于产业化规模化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生产成本低、无需添加昂贵的辅酶B12、利用重组微生物直接将可发酵糖转化成1,3-丙二醇的新方法。本专利技术首先提供一种重组微生物，该重组微生物能够过表达：(1)乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和accDA；(2)丙二酰辅酶A合成酶基因mcr；(3)3-羟基丙酰辅酶A合成酶基因pcs；(4)3-羟基丙酰辅酶A还原酶基因pduP；(5)1,3-丙二醇还原酶基因yqhD。本领域技术人员应当理解，本专利技术所述微生物可选择常用的模式微生物，包括但不限于为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或酿酒酵母。本专利技术的重组微生物能够表达乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和accDA，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-2所示。在本专利技术的实施例中，乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和accDA来源于谷氨酸棒杆菌。进一步地，本专利技术的重组微生物能够表达丙二酰辅酶A合成酶基因mcr的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的实施例中，丙二酰辅酶A合成酶基因mcr来源于嗜热光合绿曲菌。更进一步地，本专利技术的重组微生物能够表达3-羟基丙酰辅酶A合成酶基因pcs、3-羟基丙酰辅酶A还原酶基因pduP、1,3-丙二醇还原酶基因yqhD；在本专利技术的实施例中，所述3-羟基丙酰辅酶A合成酶基因pcs来源于Metallosphaerasedula，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述3-羟基丙酰辅酶A还原酶基因pduP来源于克雷伯氏肺炎杆菌，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；所述1,3-丙二醇还原酶基因yqhD来源于大肠杆菌，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。本领域技术人员应当理解，本申请不限于实施例来源的菌株的酶，其他来源具有相同功能的酶也可以实现相同的技术效果。在本专利技术的实施例中，所述重组微生物通过以下方法构建得到：(1)将序列如SEQIDNO.1所示的accBC基因和如SEQIDNO.2所示的accDA基因连接到pACYCDuet上，获得的重组质粒pACYC-accDABC；(2)以SEQIDNO.3所示的片段为模板，SEQIDNO.11-12所述序列为引物PCR扩增得到的3.7kb的mcr片段连接到pACYC-accDABC上，获得的重组质粒pACYC-accDABC-mcr；将该重组质粒转入到大肠杆菌中，筛选获得重组菌E.coli/pACYC-accDABC-mcr；(3)以SEQIDNO.4所示的片段为模板，SEQIDNO.13-14所述序列为引物PCR扩增得到的2.0kb的pcs片段；将pcs片段、SEQIDNO.5所示的pduP片段和SEQIDNO.6所示的yqhD片段连接到pET28a上，获得的重组质粒pET-pcs-pduP-yqhD；(4)将pET-pcs-pduP-yqhD转入步骤(2)的重组菌E.coli/pACYC-accDABC-mcr中，筛选获得重组菌E.coli/pACYC-accDABC-mcr/pET-pcs-pduP-yqhD，即为本专利技术所述的重组微生物。本专利技术提供了上述重组微生物在发酵糖类生产1,3-丙二醇中的应用。本专利技术提供了一种利用所述的重组微生物发酵生产1,3-丙二醇的方法，包括以下步骤：(1)构建能够过表达乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和accDA、丙二酰辅酶A合成酶基因mcr、3-羟基丙酰辅酶A合成酶基因pcs、3-羟基丙酰辅酶A还原酶基因pduP、1,3-丙二醇还原酶基因yqhD的重组微生物；(2)以含可发酵糖的原料为底物进行好氧发酵，发酵过程无需添加辅酶维生素B12。步骤(2)所述含可发酵糖的原料为糖蜜，蔗糖、葡萄糖、淀粉水解液、玉米浆、木糖、甘露糖或甘油；步骤(2)的发酵条件为，28-37℃，pH值5-8，溶氧值大于10％。优选地，步骤(2)的发酵条件为，30-37℃，pH值6-7，溶氧值大于10％。步骤(2)发酵底物还含有Na2HPO4，KH2PO4，MgSO4，NaCl,酵母粉，NH4Cl，盐酸硫胺素,生物素。本专利技术提出了1,3-丙二醇的合成路线如图1所示：首先葡萄糖(或其他可发酵糖)在微生物自身糖酵解途径的作用下生成乙酰辅酶A；乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶的催化下生成丙二酰辅酶A；丙二酰辅酶A在丙二酰辅酶A还原酶的催化下生成丙二酸半醛；丙二酸半醛在丙二酸半醛还原酶的作用下生成3-羟基丙酸；3-羟基丙酸在3-羟基丙酸辅酶A合成酶的作用下生成3-羟基丙酸辅酶A；3-羟基丙酸辅酶A在3-羟基丙酸辅酶A还原酶的作用下生成3-羟基丙醛；3-羟基丙醛在1,3-丙二醇还原酶的作用下生成1,3-丙二醇。本专利技术利用能够本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组微生物，其特征在于，该重组微生物能够过表达：(1)乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和accDA；(2)丙二酰辅酶A合成酶基因mcr；(3)3‑羟基丙酰辅酶A合成酶基因pcs；(4)3‑羟基丙酰辅酶A还原酶基因pduP；(5)1,3‑丙二醇还原酶基因yqhD。

【技术特征摘要】
1.一种重组微生物，其特征在于，该重组微生物能够过表达：(1)乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和accDA；(2)丙二酰辅酶A合成酶基因mcr；(3)3-羟基丙酰辅酶A合成酶基因pcs；(4)3-羟基丙酰辅酶A还原酶基因pduP；(5)1,3-丙二醇还原酶基因yqhD。2.如权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌或酿酒酵母。3.如权利要求1或2所述的重组微生物，其特征在于，accBC和accDA的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示。4.如权利要求1或2所述的重组微生物，其特征在于，丙二酰辅酶A合成酶基因mcr的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。5.如权利要求1或2所述的重组微生物，其特征在于，3-羟基丙酰辅酶A合成酶基因pcs的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。6.如权利要求1或2所述的重组微生物，其特征在于，3-羟基丙酰辅酶A还原酶基因pduP的核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈振，刘德华，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11