一种利用微生物发酵生产虾青素的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用微生物发酵生产虾青素的方法，属于生物工程发酵技术领域。本发明专利技术利用微生物发酵生产虾青素，虾青素的产量达到450mg/L，所利用的原料比较廉价，生产成本大大降低，为快速高效生产天然虾青素提供有效的方法。

Method for producing astaxanthin by microorganism fermentation

The invention discloses a method for producing astaxanthin by microbial fermentation, belonging to the technical field of biological engineering fermentation. The invention of astaxanthin production by fermentation of microorganism, astaxanthin yield reached 450mg/L, the use of relatively inexpensive raw materials, greatly reducing the production cost and provide an effective method for rapid and efficient production of natural astaxanthin.

【技术实现步骤摘要】
一种利用微生物发酵生产虾青素的方法
本专利技术涉及一种利用微生物发酵生产虾青素的方法，属于生物工程发酵

技术介绍
虾青素(3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，又称虾红素)，化学分子式为C40H52O4，为萜烯类不饱和化合物，是一种在自然界中广泛存在的天然类胡萝卜素，许多甲壳动物如虾、龙虾、螃蟹等体内都含有虾青素，虾青素本身为红色，当它和蛋白质结合时可以呈现出深蓝或绿色，而在加工过程中由于加热破坏了虾青素与蛋白质的结合而恢复了虾青素本来的颜色。国内外大量研究表明，虾青素具有超强的抗氧化活性，在增强免疫力、抑制肿瘤、抑制糖尿病肾病、清除自由基和活性氧等方面具有非常积极的作用。其不仅可以用作珍贵水产动物养殖的饵料添加剂和人类的食品添加剂，在药品、化妆品和高级营养保健品等领域也具有极大的应用潜力。目前，虾青素的生产工艺主要有从水产品加工废弃物中提取虾青素、利用藻类如雨生红球藻等生产虾青素、利用红法夫酵母发酵生产虾青素和化学合成法等等。化学合成的虾青素同天然虾青素在结构、功能、应用及安全性等方面有着显著差异，美国食品与药物管理局已禁止化学合成的虾青素进入保健食品市场。目前，虾青素的生产一般倾向于开发天然虾青素的生物来源。天然虾青素的主要来源有水产品废弃物、红发夫酵母和微藻，由于水产废弃物和微藻中虾青素含量较低，且提取费用较高，不适于进行大规模生产。
技术实现思路
本专利技术首先提供了一种可用于产天然虾青素的酵母菌(Yarrowialipolytica)As，于2016年11月17日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2016644，保藏地址为中国武汉武汉大学。本专利技术还提供了应用所述微生物发酵产虾青素的方法，包括以下步骤：(1)制备种子培养液：将保存的菌株，接种于液体种子培养基中，在28～30℃，180～200rpm/min条件下，培养20～24h，得到种子培养液；(2)发酵产虾青素：按1～10％的比例将种子培养液接种于发酵培养基，罐温28～30℃，通风量：1.0-5.0VVM，pH：氢氧化钠或氨水控制pH在4.0～6.0，培养时间：55～75小时。在本专利技术的一种实施方式中，发酵发酵20-30h后开始采取Do-stat方式补料，控制溶氧不低于10～30％。补料培养基配方为：甘油500g/L、KH2PO45g/L、MgSO43g/L。发酵55-75h结束，取样测定发酵液中虾青素含量为400mg/L，纯度为82.6％。在本专利技术的一种实施方式中，发酵培养基配方为：称取甘油120g、酵母浸膏10.5g、KH2PO46.75g、MgSO42.1g、(NH4)2SO422.8g、肌醇0.15g，加入1500mL去离子水，121℃、20mins灭菌，加入混合维生素溶液10mL/L，混合金属离子溶液10mL/L。混合维生素溶液组成为：泛酸:5.4g/L、吡哆醇:1.4g/L、烟酸:6.1g/L、叶酸:0.04g/L、生物素:0.06g/L，过滤除菌。混合金属离子溶液组成为：Fe3Cl3.6H2O:2.7g/L、ZnSO4.7H2O:1.4g/L、CaCl2.2H2O:2.0g/L、Na2MoO4.2H2O:2.0g/L、CuSO4.2H2O:1.9g/L、H3Bo3:0.5g/L、MnSO4.H2O:2.0g/L，121℃、20mins灭菌。在本专利技术的一种实施方式中，种子培养基配方为：称取甘油2g、酵母浸膏0.3g、KH2PO40.45g、MgSO40.2g、(NH4)2SO42.4g、肌醇0.01g，加入100mL去离子水，121℃、20mins灭菌，加入混合维生素溶液10mL/L，混合金属离子溶液10mL/L。在本专利技术的一种实施方式中，发酵时接种量为10％。在本专利技术的一种实施方式中，发酵温度为30℃。在本专利技术的一种实施方式中，发酵时控制pH为4.0。在本专利技术的一种实施方式中，3L发酵罐初始温度28℃，搅拌转数200rpm，通风比1L/min条件下培养；发酵20-26h后进入补料时期，搅拌转数提高至1200rpm，通风为1-5L/min，用NaOH控制pH4.0，开始补料。在本专利技术的一种实施方式中，发酵初期用NaOH控制pH4.0，进入补料时期，改用NH3H2O控制pH4.0。本专利技术是利用微生物发酵生产虾青素，与现有技术相比优势在于，虾青素的产量得到了有效地提高，为450mg/L，所利用的原料比较廉价，生产成本大大降低，为快速高效生产天然虾青素提供有效的方法。生物材料保藏一种可用于产天然虾青素的酵母菌(Yarrowialipolytica)As，于2016年11月17日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2016644，保藏地址为中国武汉武汉大学。附图说明图1是虾青素的HPLC图谱。图2是不同接种量条件下虾青素的产量。图3是不同pH条件下虾青素的产量。图4是分阶段控制pH条件下虾青素的产量图5是不同传代数条件下虾青素的产量。具体实施方式分析方法：采用高效液相色谱法分析发酵液中的虾青素。其中，测定采用岛津SPD-M20A二极管阵列检测器，Phenomenexluna5uC18色谱柱(150mm×4.6mm，5μ)；流动相85％乙腈：15％异丙醇；流速1.5ml/min；柱温35℃；进样量10μL。甘油的测定采用示差检测器；Phenomenexluna5uNH2色谱柱(250mm×4.6mm，5μ)，柱温30℃；RID温度35℃；流动相85％乙腈，流速1.0ml/min；进样量10μL。实施例1种子液的培养⑴发酵菌种的准备：取保存在-80℃的Yarrowia菌种于固体培养基中，划线培养，培养温度28℃～30℃，培养24～48h。固体培养基的配制方法：成分为酵母浸膏1g、蛋白胨2g、葡萄糖2g、琼脂粉1.5g，然后用去离子水定容到100ml，在温度121℃、高压蒸汽灭菌15～20min，冷却制得固体平板。⑵种子液培养：将甘油管保藏菌接种于种子液中，在温度30℃、转速200r/min，培养20～26h，培养至对数期。种子培养基的配制方法：成分为甘油2g、酵母浸膏0.3g、KH2PO40.45g、MgSO40.2g、(NH4)2SO42.4g、肌醇0.01g然后用去离子水定容至100ml，在温度121℃、高压蒸汽灭菌20min，冷却后加入混合维生素溶液1mL，混合金属离子溶液1mL，制得种子培养基。实施例2摇瓶发酵培养取实施例1中Yarrowia种子液按接种量10％(V/V)接种于发酵培养基中，在温度28℃～30℃、转速200r/min培20～30h。发酵培养基制备：成分为甘油120g、酵母浸膏10.5g、KH2PO46.75g、MgSO42.1g、(NH4)2SO422.8g、肌醇0.15g，然后用去离子水定容到1.5L，在温度121℃、高压蒸汽灭菌20min，冷却后加入混合维生素溶液15mL，混合金属离子溶液15mL，制得发酵液。实施例33L发酵罐生产虾青素⑴取甘油管保存菌株，接种于装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃，200rpm摇床培养20～30h。种子培养基配方和实施例1相同。⑵将培养好的种子液按10％接种量接种于3L发酵罐，开始发酵本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可用于产天然虾青素的酵母菌(Yarrowia lipolytica)As，于2016年11月17日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016644，保藏地址为中国武汉武汉大学。

【技术特征摘要】
1.一种可用于产天然虾青素的酵母菌(Yarrowialipolytica)As，于2016年11月17日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2016644，保藏地址为中国武汉武汉大学。2.一种应用权利要求所述微生物发酵产虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备种子培养液：将保存的菌株，接种于液体种子培养基中，在28～30℃，180～200rpm/min条件下，培养20～24h，得到种子培养液；(2)发酵产虾青素：按1～10％的比例将种子培养液接种于发酵培养基，罐温28～30℃，通风量1.0-5.0vvm，以氢氧化钠或氨水控制pH在4.0～6.0，发酵时间为55～75小时。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵发酵20-30h后开始采取Do-stat方式补料，控制溶氧不低于10～30％；补料培养基配方为：甘油500g/L、KH2PO45g/L、MgSO43g/L。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养基配方为：称取甘油120g、酵母浸膏10.5g、KH2PO46.75g、MgSO42.1g、(NH4)2SO422.8g、肌醇0.15g，加入1500mL去离子水，121℃、20mins灭菌，加入混合维生素溶液10mL/L，混合金属离子溶液10mL/L。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，种子培养基配方为：称取甘油2g、酵母浸膏0.3g、KH...

【专利技术属性】
技术研发人员：余晓丹，王艳娜，伍奕晟，
申请(专利权)人：无锡新和源发酵技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32