本发明专利技术公开了一种发酵生产L‑丙氨酸的大肠杆菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术在能够发酵生产富马酸的大肠杆菌中引入天冬氨酸酶AspA和L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶AsD，进一步过量表达YgaW基因强化了重组菌中L‑丙氨酸的转运能力，构建了可以利用葡萄糖发酵生产L‑丙氨酸的新型菌种，利用该重组菌株在发酵罐中发酵45h，L‑丙氨酸产量达到147g/L，糖酸转化率79.0％。
【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产L-丙氨酸的大肠杆菌及其应用
本专利技术涉及一种发酵生产L-丙氨酸的大肠杆菌及其应用，属于生物工程
技术介绍
L-丙氨酸是一种非必需氨基酸，也是人体血液中含量最高的氨基酸，在L-丙氨酸在工业、日化、食品等领域用途广泛。在日化领域，L-丙氨酸是合成氨基酸表面活性剂的重要原料，在食品领域，L-丙氨酸可以作为天然甜味剂对改善调味剂的味感和有机酸的酸。在医药领域，L-丙氨酸也是合成维生素B6和氨基丙醇的主要原料。L-丙氨酸的生产工艺包括提取法、化学合成法、酶催化法和发酵法。目前工业生产上主要采用酶催化法，即通过培养富有L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD(EC4.1.1.12)活力的微生物细胞，催化L-天冬氨酸得到L-丙氨酸。酶法转化工艺的特点是酶活力高，设备要求简易，提取工艺简单，但野生型微生物培养生产AsD需要以富马酸或谷氨酸钠为碳源，生长周期长、且培养成本高，同时主要原材料L-天冬氨酸价格高，造成其生产成本高。徐友强等通过克隆来源于睾丸酮丛毛单胞菌(Comonastestosteroni)的asD基因，在一株具有L-天冬氨酸酶(AspA)生产能力的大肠埃希氏菌CICC11022S中异源表达，构建转化富马酸生产L-丙氨酸的重组工程菌，重组菌9h转化富马酸产生112.7g/L的L-丙氨酸，转化率93.8％。该方法以大Escherichiacoli为酶源菌株和富马酸为底物，生产的原料成本显著降低，但是富马酸是经石油炼制生产的，其价格受困于原油价格，同时石油资源日渐短缺且不可再生。张学礼等利用基因工程手段删除L-丙氨酸合成的关键5条竞争途径，过量表达限速步骤酶L-丙氨酸脱氢酶，强化丙酮酸向L-丙氨酸的生产路径，构建大肠杆菌重组菌，以葡萄糖为原料，自来水配制培养基，发酵48h可以生产114g/LL-丙氨酸。发酵原料葡萄糖廉价易得，培养基成分简单，厌氧发酵动力消耗低，产品收率高。目前构建L-丙氨酸生产菌株的构建方法单一，涉及多条竞争路径，基因工程操作复杂。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术通过大肠杆菌发酵生产富马酸，利用天冬氨酸酶AspA转化为天冬氨酸，进一步利用L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD转化天冬氨酸生产L-丙氨酸，构建了高效生产L-丙氨酸的新型菌种。本专利技术的第一个目的是提供一种大肠杆菌重组菌，所述大肠杆菌重组菌是通过在能够产富马酸的大肠杆菌中，过表达天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD。在本专利技术的一种实施方式中，所述天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD通过核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的RBS1相连接。在本专利技术的一种实施方式中，所述天冬氨酸酶AspA编码基因aspA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD编码基因asD的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述产富马酸的大肠杆菌为大肠杆菌CICC.23846。在本专利技术的一种实施方式中，通过pEtac质粒串联表达所述天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌重组菌在L-丙氨酸转运蛋白AlaE编码基因YgaW上游整合了组成型启动子J23119。在本专利技术的一种实施方式中，所述L-丙氨酸转运蛋白AlaE编码基因YgaW的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第二个目的是提供所述大肠杆菌重组菌的构建方法，所述方法具体是：(1)使用pEtac质粒，以核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的RBS1作为连接肽，串联表达核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的天冬氨酸酶AspA和核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD，构建重组质粒pETac-aspA-asD；(2)将重组质粒pETac-aspA-asD导入大肠杆菌CICC.23846中；(3)在核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的L-丙氨酸转运蛋白AlaE基因上游离整合组成型启动子J23119，再导入步骤(2)所述的重组菌中，获得重组大肠杆菌E.coliP-119。本专利技术第三个目的是提供一种利用所述重组大肠杆菌E.coliP-119发酵生产L-丙氨酸的方法，所述方法具体是：将摇瓶种子3～5％接种量接种于发酵培养基，稀硫酸和氨水控制pH在6.8～7.2，通气量0.1～1vvm，温度34～36℃，搅拌80～120rpm，当OD600达到10～15时，加入2～3g/L乳糖诱导天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶的表达，发酵过程当葡萄糖浓度低于10～15g/L时，补加500～700g/L葡萄糖溶液，每升发酵液补加20～40g葡萄糖，共补加2～6次，当葡萄糖消耗尽后结束发酵。本专利技术的一种实施方式中，发酵培养基成分为：初始葡萄糖60～80g/L，酵母粉4～6g/L，胰蛋白胨1～3g/L，(NH4)2SO41～3g/L，K2HPO4·12H2O3～5g/L，KH2PO43～5g/L，MgSO4·7H2O0.4～0.6g/L，一水合柠檬酸0.2～0.4g/L，MnCl2·4H2O0.06～0.1g/L。本专利技术的第四个目的是提供所述大肠杆菌重组菌在生产L-丙氨酸中的应用。本专利技术的有益之处：大肠杆菌做为最常用的细胞工厂，遗传背景清晰，在能够发酵生产富马酸的大肠杆菌中引入天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD，将发酵生产的富马酸直接转化为L-丙氨酸，进一步过量表达AlaE强化了重组菌中L-丙氨酸的转运能力，构建了可以利用廉价葡萄糖发酵生产L-丙氨酸的高产菌株，目前该生产路径目前尚无相关报道。附图说明图1：pEtac-aspA-asD共表达质粒的构建。具体实施方式下述实施例中，都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得。下述实施例中，大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)为出发菌株，购自于CICC，编号23846，也适用于其他可以生产富马酸的大肠杆菌。氨基酸检测采用常规的高效液相色谱检测。天冬氨酸酶AspA酶活检测：将27mL浓度约为180g/L的富马酸氨水(pH＝8.5)溶液37℃预热，分别称取0.5g左右的湿菌体于250mL锥形瓶中，加入0.09gCTAB粉末和2.5mL离子水，加入预热的转化液中，保鲜膜封口后置于37℃、200rpm的摇床中反应15min。反应完成后，取适量反应液快速离心稀释进行液相检测。L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD酶活检测：将15mL浓度为30g/L的天冬氨酸溶液(用氢氧化钠溶液调节pH7.0)37℃预热，分别称取1g左右诱导12h的湿菌体于250mL锥形瓶中，加入0.09gCTAB粉末和14mL去离子水，加入预热的转化液中，保鲜膜封口后置于37℃、200rpm的摇床中反应15min。反应完成后，取适量反应液快速离心稀释进行液相检测。酶活力单位(U)：每分钟生产1μmoL产物所需要的酶量定义为1个酶活单位。葡萄糖测定方法：使用SBA-40生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)进行分析。生产强度的计算：生产强度(g/L/h)＝L-丙氨酸产量(g/L)/发酵时间(h)。实施例1：双酶共表达菌株的构建(1)使用细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌K12和睾丸酮丛毛单胞菌的基因组DNA；(2)使用表1中引物AspA-up本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌重组菌是通过在能够产富马酸的大肠杆菌中，过表达天冬氨酸酶AspA和L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶AsD。
【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌重组菌是通过在能够产富马酸的大肠杆菌中，过表达天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD。2.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD通过核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的RBS1相连接。3.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述天冬氨酸酶AspA编码基因aspA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD编码基因asD的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述产富马酸的大肠杆菌为大肠杆菌CICC.23846。5.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，通过pEtac质粒串联表达所述天冬氨酸酶AspA和L-天冬氨酸-β-脱羧酶AsD。6.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌重组菌在L-丙氨酸转运蛋白AlaE编码基因YgaW上游整合了组成型启动子J23119。7.根据权利要求1所述的大肠杆菌重组菌，其特征在于，所述L-丙氨...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐俊平，张帆，刘佳，刘立明，
申请(专利权)人：金华利家园生物工程有限公司，江南大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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