本发明专利技术属于抗体工程领域，具体涉及一株能稳定表达抗干扰素γ（IFN‑γ）的基因工程单链抗体株及其应用。本发明专利技术通过基因工程手段在体外克隆干扰素γ的基因，构建原核表达载体，IPTG诱导表达纯化获得可溶的干扰素抗原蛋白。利用噬菌体展示技术，淘选出能稳定分泌表达抗（IFN‑γ）的基因工程单链抗体株，并通过构建原核表达载体表达纯化出具有功能的单链抗体，利用竞争ELISA方法，实现对人血液中IFN‑γ的定性与定量检测，为商品化的开发生产高质量的酶联免疫检测试剂盒和金标抗体检测卡奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
一株能稳定表达抗干扰素γ的基因工程单链抗体株及应用
本专利技术属于抗体工程领域，具体涉及一株能稳定表达抗干扰素γ的基因工程单链抗体株及其应用。
技术介绍
干扰素γ（Interferon-γ,IFN-γ）是一种主要由活化T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）产生分泌的细胞因子，属于是II型干扰素的唯一成员。干扰素γ单体是由六个α螺旋组成一个核心和在C端区延伸展开的片断序列。具有生物活性的干扰素γ二聚体是由两个反平行相互锁定的单体形成，广泛存在于人类和哺乳动物的血液中。干扰素γ具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤特性。还有研究报道，干扰素可以用来治疗传染病，但也能促成自身免疫。目前，针对人血液中的干扰素γ检测技术普遍采用的是电化学类方法，主要包括环化金属铱传感器检测（Cyclometalatediridium（III）complexconductor）、微型可视化电传感器（Micropatternedapatamer-modifiedelectrodes）、基于DNA适配体电化学检测（DNAaptamer-basedelectrochemicalbiosensor）等。上述的基于电化学方法的干扰素γ检测虽然具有较高的检测灵敏度，但是检测耗时且对样品的纯度要求高，操作复杂、环境要求高且稳定性差、需要专业的检测机构和技术人员，因此不适合推广和用于实际临床血液样品中干扰素γ的快速准确的检测。免疫分析法（Immuno-analysis）方法是近十多年来发展起来的新方法，是将抗原抗体反应与灵敏的检测系统结合而成的一种分析方法，具有特异性好、灵敏度高、操作技术简单、成本低、对样品的纯度要求不高等优点，特别适合于大批量样本的检测，近年来被广泛普及应用于各种毒素的检测。干扰素γ是抗原刺激下淋巴细胞所产生的。干扰素γ具有很强的抗病毒活性，而且干扰素能够抑制多种病毒的增殖，在医学上是一类广谱的抗病毒药物。同时，干扰素γ是评估机体细胞免疫应答的重要检测指标，在实际的临床医学中具有极其重要检测和诊断意义。为此，对于医院、研究所和卫生防疫部门来说，更需要一个简便、快速、灵敏的方法对干扰素γ进行检测。但目前为止，基于基因工程抗体的对干扰素γ进行免疫学检测方法的研究还没见报道。因此，制备针对干扰素γ的高亲和力特异性强的基因工程抗体并建立基于基因工程抗体的免疫学检测方法，为最终开发基于基因工程抗体的商品化检测试剂盒与胶体金检测卡奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株能稳定表达高亲和力的抗干扰素γ（IFN-γ）基因工程单链抗体株。本专利技术首先提供一株抗IFN-γ毒素的基因工程单链抗体株pET28a-mbp-linker-scFv-A8/BL21。所述抗体株为大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）pET28a-mbp-linker-scFv-A8/BL21，已于2017年11月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.14860，地址为北京市朝阳区北层西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。其次提供一种有所述的单链抗体株pET28a-mbp-linker-scFv-A8/BL21表达的单链抗体。所述的基因工程单链抗体的制备方法，是将噬菌体展示淘选得到的单链抗体基因扩增，克隆到原核表达载体中，并转化大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达纯化，获得的具有IFN-γ抗原结合活性的单链抗体。本专利技术还提供了所述单链抗体在制备检测IFN-γ试剂盒及检测卡中的应用，是利用抗原抗体反应原理将产生的单链抗体用于在临床血液样品中检测干扰素γ（IFN-γ）。所述的单链抗体pET28a-mbp-linker-scFv-A8/BL21的应用，一是将所述的单链抗体配置在检测IFN-γ的免疫检测试剂盒中。本专利技术的优点在于：本专利技术通过克隆IFN-γ基因，构建体外表达载体，通过IPTG诱导表达和亲和层析纯化获得高纯度的可溶的IFN-γ抗原蛋白。经动物免疫后，利用噬菌体展示技术，淘选出能稳定分泌表达抗IFN-γ的基因工程单链抗体株，并通过构建原核表达载体表达纯化出具有功能的单链抗体，组装ELISA检测试剂盒，实现对血液样品中IFN-γ的定性与定量检测，为商品化的开发生产高质量的酶联免疫检测试剂盒和金标抗体检测卡奠定了基础。附图说明图1干扰素γ抗原表达纯化与动物免疫。其中A为IFN-γ蛋白原核表达纯化结果；B为免疫的小鼠血清效价测定结果。图2A为噬菌体抗体库淘选结果。图2B为单链抗体株PCR检测结果。图2C为单链抗体株的ELISA鉴定结果。图3A为scFv原核表达载体构建示意图。图3B为scFv融合蛋白表达SDS-PAGE电泳结果。图3C为scFv融合蛋白表达可溶性分析结果。图4A为scFv融合蛋白纯化结果分析。图4B为scFv融合蛋白与抗原相互作用ELISA检测结果。图4C为scFv融合蛋白与抗原相互作用WesternBlotting检测结果。图5A为scFv抗体的特异性分析。图5B为scFv抗体分子亲和力测定。图6A为间接竞争ELISA检测曲线。图6B为间接竞争ELISA检测标准曲线。具体实施方式实施例1一、本专利技术单链抗体的制备与鉴定。1、干扰素γ抗原的表达与纯化本实验将以干扰素γ抗原DNA序列为模板，设计特异性引物(IFN-γ-F:CAAGAATTCTGTTACTGCCAGGACCCATATGT;IFN-γ-R:TTAAAGCTTCTGGGATGCTCTTCGACCTCGA)进行PCR扩增，利用EcoRI和HindIII限制性内切酶进行酶切，与相同酶切的原核表达载体pET28a进行连接，构建重组表达载体pET28a-IFN-γ。转化大肠杆菌感受态细胞BL21，IPTG（浓度为1mM/L）诱导表达，将表达产物经Ni2+亲和层析获得高纯度的IFN-γ抗原蛋白。具体步骤如下：1）、IFN-γ基因扩增反应体系：PCRmixture25µLIFN-γ-F(20mM)0.5µLIFN-γ-R(20mM)0.5µLTemplateDNA2µLddH2O25µLPCR扩增条件为：94℃5min,94℃45s，53℃45s，72℃30s，反应30个循环；72℃延伸5min。2）、PCR产物回收，酶切与连接PCR得到的产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，切割凝胶上的目的条带经Fermentas公司胶回收试剂盒进行回收目的DNA片段。将回收得到的PCR产物双酶切后与同样酶切的载体DNA进行连接，二者的连接反应摩尔比例为3:1。16℃进行连接过夜。连接体系：VectorDNA（doubledigested）0.5µLTargetDNA（doubledigested）2.0µL10×buffer1.0µLT4-DNAligase0.5µLddH2Oupto10µL3）、重组质粒的转化将16℃连接好的3µLDNA产物在无菌条件下加入预冷的50µLBL21感受态细胞中，用食指指尖轻轻弹击EP管底部，约5-6次即可将连接产物与感受态细胞混匀。将EP管轻轻插入冰中，放置至少30min。将EP管转移至42℃恒温水浴锅中，温浴60s。再将EP管放置于冰上3min，迅速在超净工作台中向EP管中加入900µL预热的SOC溶液，上下倒置混匀。37℃振荡培养60min，4000r/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株能稳定表达抗干扰素γ的基因工程单链抗体株，其特征在于：所述抗体株为大肠埃希氏菌（
【技术特征摘要】
1.一株能稳定表达抗干扰素γ的基因工程单链抗体株，其特征在于：所述抗体株为大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）pET28a-mbp-linker-scFv-A8/BL21，已于2017年11月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.14860。2.一种由权利要求1所述的基因工程单链抗体株分泌的单链抗体。3.权利要求2所述单链抗体的制备方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王荣智，杨航，王俊程，钟燕芳，汪世华，凌素美，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建,35
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。