羊种布鲁氏菌per基因缺失菌株、其构建方法及应用技术

发明专利技术提供一株羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis,B.melitensis)M5‑90‑Δper，所述菌是用卡那霉素抗性基因替换羊种布鲁氏菌M5‑90的per基因编码区构建得到的。本发明专利技术以羊种布鲁式菌M5‑90为出发菌株，以其基因组为模板，通过扩增per基因上、下游同源臂，同时利用卡那霉素抗性基因替换per基因编码区，构建pGEM‑Δper同源重组质粒，将该质粒电转化羊种布鲁式菌M5‑90感受态细胞，所得阳性转化子即为per基因缺失的羊种布鲁式菌M5‑90‑Δper。本发明专利技术的M5‑90‑Δper株为布鲁氏菌介导的细胞自噬与感染机制奠定了重要基础。

Brucella abortus per gene deletion strain, its construction method and Application

The invention provides a strain of Brucella melitensis (B.melitensis) M5 (B.melitensis) M5 delta per, which is constructed by the per gene coding region of the kanamycin resistant gene of the sheep Brucella strain 90. This invention takes Bruce strain M5 90 as the starting strain, and uses its genome as a template to construct a pGEM delta per homologous recombinant plasmid by amplifying the per gene and downstream homologous arm and using kanamycin resistance gene to replace the per gene encoding region. The plasmid is transformed into a sheep species of Bruce strain 90 receptive cells. The positive transformant was the Brucella per M5 90 per. The M5 90 per strain has laid an important foundation for Brucella mediated autophagy and infection mechanism.

【技术实现步骤摘要】
羊种布鲁氏菌per基因缺失菌株、其构建方法及应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及一株羊种布鲁氏菌per基因缺失菌株，还涉及所述菌株的构建方法及其应用。
技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏杆菌(Brucella)引起的一种人畜共患传染病，该病主要传染对象羊，其次为猪和牛，每年给我国畜牧业造成巨大的经济损失，同时严重威胁着人类的健康。近年来，该病在我国范围内有逐步回升的趋势。目前，该病的预防主要依赖于疫苗免疫，特别是在发展中国家，接种疫苗是预防该病的主要手段。我国预防该病的疫苗之一为M5-90，由哈尔滨兽医研究所自主研发的M5-90疫苗株能够在一定程度上预防绵羊和山羊布鲁氏菌病，但该疫苗也存在着许多缺陷，如该疫苗株接种动物后毒力还很强、容易引起怀孕母畜流产和无法区分自然免疫和疫苗免疫，使得该疫苗的应用具有很大的局限性，因此，该疫苗的进一步改造对于成功防治布鲁氏菌病具有十分重大的意义。研究发现，布鲁氏菌的毒力因子主要包括外膜蛋白(Outermembraneprotein,OMP)成分和脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)成分。布鲁氏菌脂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis,B.melitensis)M5‑90‑Δper，所述菌是用卡那霉素抗性基因替换羊种布鲁氏菌M5‑90的per基因编码区构建得到的。

【技术特征摘要】
1.一株羊种布鲁氏菌(Brucellamelitensis,B.melitensis)M5-90-Δper，所述菌是用卡那霉素抗性基因替换羊种布鲁氏菌M5-90的per基因编码区构建得到的。2.羊种布鲁氏菌M5-90-Δper的构建方法，所述方法包括以下步骤：(1)根据羊种布鲁氏菌M5-90的基因序列和pEGFP-N1载体的基因序列以及pGEM-7Zf(+)载体特点，设计构建per基因缺失株所需的相应引物；(2)提取羊种布鲁氏菌M5-90菌的基因组并于-20℃保存；(3)以步骤(2)得到的基因组为模板，扩增per基因左同源臂per-C端、per-N端，以pEGFP-N1质粒为模板，扩增卡那霉素抗性基因Kana；(4)分别回收和纯化步骤(3)的PCR扩增产物，得到per-C端、per-N端和Kana基因(5)将步骤(4)得到的per-C端、per-N端和Kana基因分别与pMD20-T载体4℃连接，分别得到重组质粒；(6)步骤(5)得到的连接产物分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过测序确认得到重组质粒pMD20-per-C、pMD20-per-N和pMD20-Kana；(7)分别利用SmaI和SacI对重组质粒pMD20-per-C进行双酶切，利用SmaI和SacI对自杀载体pGEM-7Zf(+)进行双酶切，利用XhoI与SmaI分别对重组质粒pGEM-C和pMD20-Kana进行双酶切，胶回收试剂盒纯化目的片段，得到粘...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦寒伟，帅学宏，黄庆洲，郭芳芳，伍莉，陈吉轩，甘玲，罗献梅，王红均，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50