一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法，包括以下步骤：制备产番茄红素的大肠杆菌菌株，将大肠杆菌菌株中的野生型crp基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-crp，通过碱基替换：得到优化的重组载体pKSC-crp1；最后用pKSC-crp1中的crp1基因替换野生型crp基因，得到番茄红素高产量的菌株。本发明专利技术通过对大肠杆菌菌株中的野生型crp基因的碱基替换A26T，影响其所调控的各种基因的转录水平，调节番茄红素合成直至整个菌体的代谢网络，进而提高番茄红素在大肠杆菌中的合成能力。此方法能有效提高大肠杆菌合成番茄红素的能力，对利用大肠杆菌工业化生产番茄红素具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法
本专利技术属于生物化工领域，特别涉及一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法。
技术介绍
番茄红素是一种长链不饱和碳氢化合物，是自然界中抗氧化性最强的类胡萝卜素。番茄红素广泛存在于红色的水果蔬菜中，具有抗氧化、抗癌、降血脂、提高免疫力等功能，在新型保健食品、化妆品和药品中都具有广阔的应用前景，是一种很有发展前途的新型功能性天然色素。番茄红素生产方法主要有天然提取法、化学合成法和微生物发酵法三种。从生产原料和成本、工艺以及产品活性和纯度等方面综合考虑，微生物发酵法具有明显的优势，是番茄红素理想的产业化生产方法。特别是随着转基因技术的迅速发展，利用基因工程菌生产番茄红素已成为研究的热点。转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，它控制着基因转录的开关、增强或减弱。其中，全局转录因子处于整个转录调控网络的顶端，是一类可以调节不同代谢途径中大量基因的转录因子。大肠杆菌中共有七个全局转录因子，它们能直接调控菌体内超过50%基因的转录。不仅如此，全局转录因子还能通过调控其它的转录因子，来间接控制被调控因子所负责的基因的转录表达。CRP（碳代谢总体调控蛋白）是大肠杆菌的一个重要的全局转录因子，研究表明大肠杆菌中超过95%的基因都能被CRP所直接或间接的调控。因此，可通过调控CRP这个全局转录因子，优化大肠杆菌中番茄红素合成的整体代谢网络，提高番茄红素在大肠杆菌中的合成能力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法，包括以下步骤：1.制备产番茄红素的大肠杆菌菌株：crtE、crtB、crtI是合成番茄红素所需的酶，将这三种酶的基因通过同源重组（λ-red）转入大肠杆菌（BW25113），得到产番茄红素的大肠杆菌菌株BW25113-BIE；2.将大肠杆菌菌株中的野生型crp基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-crp；crp的基因序列如SEQIDNO.1所示；crp的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；pKSC质粒的基因序列如SEQIDNO.3所示；重组载体pKSC-crp的基因序列如SEQIDNO.4所示；3.碱基替换：将步骤（2）得到的重组载体pKSC-crp上的crp基因进行碱基替换：A26T，得到优化的重组载体pKSC-crp1；pKSC-crp1的基因序列如SEQIDNO.11所示；4.用pKSC-crp1中的crp1基因替换步骤（1）得到的产番茄红素的大肠杆菌菌株BW25113-BIE中的野生型crp基因，得到番茄红素高产量的菌株BW25113-BIEcrp::crp1；crp1的基因序列如SEQIDNO.5所示；本专利技术的有益效果是：通过对大肠杆菌菌株中的野生型crp基因的碱基替换A26T，影响其所调控的各种基因的转录水平，主要调控了代谢合成相关基因、膜合成相关基因、转运相关基因、氧化还原相关基因和其它一些转录因子，从而优化番茄红素合成直至整个菌体的代谢网络，进而提高番茄红素在大肠杆菌中的合成能力，对利用大肠杆菌工业化生产番茄红素具有重要的意义。附图说明图1：重组载体pKSC-crp结构示意图；图2：本专利技术菌株BW25113-BIEcrp::crp1生产番茄红素结果图。具体实施方式该野生型crp的DNA序列及氨基酸序列分别在SEQIDNO.1和SEQIDNO.2中给出。本专利技术的转化细胞可以使用大肠杆菌细胞。上述转化细胞可以通过电穿孔法、氯化钙法等公知的方法将重组载体导入细胞进行制备。作为重组载体及转化细胞的具体例中，可以举出下列实施例中给出的重组载体pKSC-crp和用此载体得到的转化大肠杆菌BW25113/pKSC-crp。番茄红素在大肠杆菌中是在胞内积累的，这使得产番茄红素的大肠杆菌在平板上呈现红色。基于以上原理，本专利技术一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法，包括以下步骤：1.制备产番茄红素的大肠杆菌菌株：crtE、crtB、crtI是合成番茄红素所需的酶，将这三种酶的基因通过同源重组（λ-red）转入大肠杆菌（BW25113），得到产番茄红素的大肠杆菌菌株（BW25113-BIE）；2.将大肠杆菌菌株BW25113中的野生型crp基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-crp；野生型crp的基因序列如SEQIDNO.1所示，野生型crp的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，pKSC质粒的基因序列如SEQIDNO.3所示，重组载体pKSC-crp的基因序列如SEQIDNO.4所示；3.碱基替换：将步骤（2）得到的重组载体pKSC-crp上的crp基因进行碱基替换：A26T，得到优化的重组载体pKSC-crp1；pKSC-crp1的基因序列如SEQIDNO.11所示；4.用pKSC-crp1中的crp1基因替换步骤（1）得到的产番茄红素的大肠杆菌菌株中的野生型crp基因，得到番茄红素高产量的菌株BW25113-BIEcrp::crp1；crp1的基因序列如SEQIDNO.5所示。下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但不应理解为对本专利技术的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1，一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素的方法，包括以下步骤：1.制备产番茄红素的大肠杆菌菌株：crtE、crtB、crtI是合成番茄红素所需的酶，将这三种酶的基因通过同源重组（λ-red）转入大肠杆菌（BW25113），得到产番茄红素的大肠杆菌菌株（BW25113-BIE）；2.将大肠杆菌菌株中的野生型CRP基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-crp；野生型crp的基因序列如SEQIDNO.1所示，野生型crp的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，pKSC质粒的基因序列如SEQIDNO.3所示，重组载体pKSC-crp的基因序列如SEQIDNO.4所示；3.碱基替换：将步骤（2）得到的重组载体pKSC-crp上的crp基因通过以下三种方式进行碱基替换：1)A26T，得到优化的重组载体pKSC-crp1；crp1的基因序列如SEQIDNO.5所示；crp1的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示；pKSC-crp1的基因序列如SEQIDNO.11所示；2)A159C，得到优化的重组载体pKSC-crp2；crp2的基因序列如SEQIDNO.7所示；crp2的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；pKSC-crp2的基因序列如SEQIDNO.12所示；3)G424A，得到优化的重组载体pKSC-crp3；crp3的基因序列如SEQIDNO.9所示，crp3的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示；pKSC-crp3的基因序列如SEQIDNO.13所示；4.将步骤（2）得到的重组载体pKSC-crp以及步骤3得到的三个优化的重组载体pKSC-crp1、pKSC-crp2、pKSC-crp3分别转入步骤（1）得到的产番茄红素的大肠杆菌菌株中，得到4个大肠杆菌菌株，分别为BW25113-BIE/pKSC-crp、BW25113-BIE/pKSC-crp1、BW251本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备产番茄红素的大肠杆菌菌株：crtE、crtB、crtI是合成番茄红素所需的酶，将这三种酶的基因通过同源重组转入大肠杆菌，得到产番茄红素的大肠杆菌菌株BW25113‑BIE；（2）将大肠杆菌菌株中的野生型crp基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC‑crp；野生型crp的基因序列如SEQ ID NO.1所示，野生型crp的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，pKSC质粒的基因序列如SEQ ID NO.3所示，重组载体pKSC‑crp的基因序列如SEQ ID NO.4所示；（3）碱基替换：将步骤2得到的重组载体pKSC‑crp上的crp基因进行碱基替换：A26T，得到优化的重组载体pKSC‑crp1；crp1 的基因序列如SEQ ID NO.5所示，crp1 的氨基酸序列如SEQ ID NO.6 所示，pKSC‑crp1的基因序列如SEQ ID NO.11所示；（4）用pKSC‑crp1中的crp1基因替换步骤1得到的产番茄红素的大肠杆菌菌株BW25113‑BIE中的野生型crp基因，得到番茄红素高产量的菌株BW25113‑BIE crp::crp1。...

【技术特征摘要】
1.一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备产番茄红素的大肠杆菌菌株：crtE、crtB、crtI是合成番茄红素所需的酶，将这三种酶的基因通过同源重组转入大肠杆菌BW25113，得到产番茄红素的大肠杆菌菌株BW25113-BIE；（2）将大肠杆菌菌株中的野生型crp基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-crp；野生型crp的基因序列如SEQIDNO.1所示，野生型crp的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，pKSC质粒的基因序列如SEQIDNO.3所示，重组载体p...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄磊，濮悦，徐志南，蔡谨，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33