产生高产的沙门氏菌减毒菌株的方法技术

本发明专利技术涉及可用于培养伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)减毒突变株的新方法，所述菌株不具有半乳糖表异构酶活性并且含有重组的DNA分子。所述方法包括这样的步骤：培养所述伤寒沙门氏菌菌株但在发酵过程中不向培养基中添加葡萄糖，起始的葡萄糖含量在达到平台期之前耗尽。本发明专利技术还涉及可通过所述方法获得的伤寒沙门氏菌减毒突变株以及涉及可用作疫苗的含有编码VEGF受体蛋白的重组DNA分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生高产的沙门氏菌减毒菌株的方法
本专利技术涉及新的可用于产生伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)减毒突变株的方法，所述菌株不具有半乳糖表异构酶活性并且含有重组的DNA分子。所述方法包括培养所述伤寒沙门氏菌菌株的步骤，在发酵过程中不向培养基中添加葡萄糖，所述培养基中起始的葡萄糖含量在达到平台期之前耗尽。本专利技术还涉及可通过所述方法获得的伤寒沙门氏菌减毒突变株以及涉及可用作疫苗的含有编码VEGF受体蛋白的重组DNA分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株。
技术介绍
在疫苗开发的多种不同方法中，活菌苗是其中最有前景的，由于其模拟了许多病原菌的侵入途径并且能够在全身和粘膜腔两个水平上诱导有效的体液和细胞免疫应答。活菌苗可通过口腔或经鼻给药，与肠胃外给药相比其具有简单和安全的优势。批量制备成本较低并且活菌苗制剂具有高稳定性。通过缺失基因可实现减毒，所述基因包括毒性基因、调节基因和代谢基因。减毒细菌疫苗不仅可被用于诱导其相应病原菌菌株的免疫，而且可被改进后用于递送一种或多种异种抗原。肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica)的减毒产物用作递送异种抗原到哺乳动物免疫系统的载体是非常有前景的，因为肠炎沙门氏菌菌株可通过免疫系统的粘膜途径递送并且具有入侵宿主组织并存留的能力，同时可持续产生异种抗原。此外，沙门氏菌菌株可在全身和粘膜腔两种水平激发体液和细胞免疫应答。通过aro突变减毒的数种鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)已显示是动物模型中异种抗原的安全和有效的递送载体。WO03/073995中描述了通过活的鼠伤寒沙门氏菌减毒菌株将编码异种抗原的DNA结构，特别是VEGF受体蛋白递送到小鼠靶细胞的方法。Niethammer等(NatureMedicine2002,8(12),1369)揭示了含有编码鼠血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2或FLK-1)的表达载体的减毒的鼠伤寒沙门氏菌aroA菌株SL7207具有肿瘤疫苗的功能，所述鼠血管内皮生长因子受体2对肿瘤血管发生是必要的。但是，只有一种减毒的肠炎血清型沙门氏菌菌株，其称为肠炎血清型伤寒沙门氏菌Ty21a(简称：伤寒沙门氏菌Ty21a)可被接受用于人。通过化学诱变野生型毒性细菌分离株伤寒沙门氏菌Ty2并且包含galE基因的功能缺失突变以及其他未经发现的突变可获得这种耐受性好的针对伤寒的活口服疫苗。在现场试验显示有效并且安全后，其已在许多国家被批准作为伤寒疫苗。对于可安全用于人的活的减毒细菌载体用作异种抗原—特别是肿瘤抗原的递送载体具有很大的需求。提供这种减毒的细菌载体用作DNA疫苗还需要高效、高产地培养所述异种抗原DNA转化的所述减毒细菌菌株。使用重组DNA构建转化细菌菌株经常会导致细胞生长的下降。因此，通常需要改良优化的大规模培养过程以获得高产的具有活力和功能活性的细胞。专利技术目的本专利技术的目的是改进现有技术中培养伤寒沙门氏菌减毒突变株的方法。尤其是，本专利技术的目的是开发可获得含有编码异种抗原的重组DNA分子的高产有活力细菌的有效培养方法。所述方法和可通过所述方法获得的伤寒沙门氏菌减毒突变株将满足对安全的沙门氏菌作为可用于人的疫苗的需求。所述方法将尤其适合于商业大规模生产基于减毒沙门氏菌的DNA疫苗。
技术实现思路
令人意外地发现，如果在达到平台期以前培养基中葡萄糖含量减少到零，缺失半乳糖表异构酶活性的伤寒沙门氏菌减毒菌株的细胞产量会显著增加。本专利技术显示，在发酵过程中向培养基中添加葡萄糖未产生更高的细胞量/更高的OD值。相反地，在培养所述减毒沙门氏菌过程中不添加葡萄糖，在细胞生长平台期的初始阶段的OD值约为6到8，而相同的培养在葡萄糖水平约1到约4g/l，优选约2到约3g/l时(例如，通过向培养基中持续添加葡萄糖实现)得到的OD值仅为约3到约5.5。与含有葡萄糖培养的细胞相比，本专利技术所述用于培养伤寒沙门氏菌减毒突变株的方法还可产生不同形态的细胞。与含有葡萄糖培养的细胞相比，无葡萄糖条件下培养的伤寒沙门氏菌细胞更小且更短。但是，与含有葡萄糖的培养基中培养的细胞类似，这些形态不同的细胞具有完全的生物学活性，并未表现出任何细胞裂解的趋势。无论所选择的伤寒沙门氏菌减毒菌株含有编码异种抗原的重组DNA分子(例如pcDNA3.1-FLK1或其衍生的质粒例如pVAX10.VR2-1)或者不含重组DNA分子(空的减毒菌株)，通过本专利技术的方法在培养过程中不添加葡萄糖获得的细胞产量的增加都可以实现。因此，一方面，本专利技术涉及培养缺失半乳糖表异构酶活性并包含至少一个拷贝含有表达盒的DNA分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株的方法，其包括在含有蛋白胨起始pH值接近中性的缓冲培养基中以发酵规模培养所述菌株的步骤，其中发酵过程中对培养基中葡萄糖的量进行调整以使得在达到平台期之前葡萄糖含量减少到零。在一个具体的实施方案中，发酵过程中不向培养基中添加葡萄糖，并且在达到平台期之前起始的葡萄糖被耗尽。在一个具体的实施方案中，所述伤寒沙门氏菌突变株是伤寒沙门氏菌Ty21a。在一个具体的实施方案中，所述表达盒是真核表达盒。在一个具体的实施方案中，所述表达盒编码VEGF受体蛋白。在一个具体的实施方案中，所述VEGF受体蛋白选自人VEGFR-2及与其具有至少约80％同一性的同源蛋白。在一个优选的实施方案中，人VEGFR-2的氨基酸序列如SEQIDNO1所示。在一个具体的实施方案中，所述缓冲的培养基包含非动物来源的蛋白胨。在一个优选的实施方案中，所述缓冲的培养基是非动物来源的胰蛋白酶大豆液体培养基(TSB)。在一个具体的实施方案中，所述培养基的体积是至少约10L，更具体地是从约10L到约10,000L，更具体地是从约30L到约1,000L，最具体地是从约100L到约500L。在一个具体的实施方案中，所述起始葡萄糖浓度与细菌基本培养基一致或更低，具体地所述起始葡萄糖浓度从约0g/l到约4g/l。在一个具体的实施方案中，所述起始pH值是从约5到小于约9，具体地从约6到约8，更具体地从约6.5到约7.5。在一个具体的实施方案中，在所述培养过程中将所述pH值调整到约6到约8，具体地调整到pH值约6.5到约7.5。在一个具体的实施方案中，所述培养进程是通过测定光密度(OD)确定的，具体地是通过原位检测培养物的光密度或者通过取样并测定样品的光密度确定的。在另一个具体的实施方案中，所述培养进程是通过测定细胞浓度确定的，具体地是通过显微镜或通过测定电阻或通过流式细胞仪确定的。在另一个具体的实施方案中，所述培养进程是通过取样并接种到琼脂平板上来测定菌落形成单位(CFU)值确定的。在一个具体的实施方案中，在达到光密度约6时收获细胞，具体地在光密度约5到约6时收获细胞。在一个具体的实施方案中，所述伤寒沙门氏菌减毒突变株是伤寒沙门氏菌Ty21a，所述重组DNA分子包括卡那霉素抗性基因、pMB1ori和受CMV启动子控制的编码人VEGFR-2的真核表达盒。在一个具体的实施方案中，所述人VEGFR-2具有SEQIDNO2所示的核酸序列。另一方面，本专利技术涉及缺失半乳糖表异构酶活性并包含至少一个拷贝含有表达盒的重组DNA分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株，其可通过培养所述菌株获得，包括以发酵规模在含有蛋白胨起始pH值接近中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养缺失半乳糖表异构酶活性并包含至少一个拷贝的含有表达盒的重组DNA分子的伤寒沙门氏菌减毒突变株的方法，其包括以发酵规模在起始pH值接近中性的含有蛋白胨的缓冲培养基中培养所述菌株的步骤，其中发酵过程中对所述培养基中葡萄糖的量进行调整以使得在达到平台期之前葡萄糖含量减少到零。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.22 EP 11400061.51.一种培养包含至少一个拷贝的含有真核表达盒的重组DNA分子的伤寒沙门氏菌Ty21a的方法，其包括以发酵规模在起始pH值接近中性的含有蛋白胨的缓冲培养基中培养所述菌株的步骤，其中起始葡萄糖浓度为0g/l至4g/l，并且其中发酵过程中不向所述培养基中添加葡萄糖并且起始的葡萄糖含量在达到平台期之前耗尽。2.权利要求1的方法，其中所述真核表达盒是编码VEGF受体蛋白的真核表达盒，所述VEGF受体蛋白选自具有SEQIDNO1所示的氨基酸序列的人VEGFR-2及与其具有至少80％同一性的其同源蛋白。3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述缓冲的培养基包含非动物来源的蛋白胨。4.权利要求3的方法，其中所述缓冲的培养基是非动物来源的胰蛋白酶大豆液体培养基(TSB)。5.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述培养基的体积是至少10L。6.权利要求5的方法，其中所述培养基的体积是从10L到10,000L。7.权利要求6的方法，其中所述培养基的体积是从30L到1,000L。8.权利要求7的方法，其中所述培养基的体积是从100L到500L。9.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述起始pH值是从5到...

【专利技术属性】
技术研发人员：海因茨·尤贝瑙诺，霍尔格·西德，雷纳特·詹森，马尔科·施普林格，
申请(专利权)人：万科斯蒙股份有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH