一种产异戊二烯基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种产异戊二烯基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术通过将含有乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油酸水合酶的基因转化入宿主菌获得重组菌，并利用重组菌发酵生产异戊二烯。本发明专利技术所提供的方法大大缩短了大肠杆菌利用外源MVA途径合成异戊二烯的反应过程，由乙酰辅酶A仅需5步反应就可合成异戊二烯，避免了由于过多外源基因的表达而导致的对细胞自身代谢的影响。同时，通过对发酵条件的优化，发酵产物异戊二烯的产量可达39.49μg/L。

【技术实现步骤摘要】
一种产异戊二烯基因工程菌及其应用
本专利技术涉及一种产异戊二烯基因工程菌及其应用，属于基因工程
。技术背景异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95%用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径。MVA途径主要存在于真核生物、古细菌和高等植物的细胞液中，而MEP途径存在于植物的质体，细菌，藻类。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戍二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)，之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。利用MVA途径 和MEP途径生产异戊二烯的反应分别涉及8和9步反应，反应涉及过多的基因。随着分子生物学技术的发展，研究者开始探讨生物法合成异戊二烯可行性。例如Pia Lindberg等利用蓝藻的MEP途径进行异戊二烯的生产，取得了 50微克/克干细胞/天的产率(Pia Lindberg等，2009)，但藻类生长缓慢、生物量低下是利用藻类制备异戊二烯的瓶颈问题。Genencor和Goodyear公司则是将外源的MVA途径重组入大肠杆菌细胞中，进而利用工程菌发酵生产异戊二烯(美国专利公开，2009/0203102)。该工程菌中获得外源MVA途径时需要转入多达8个异源基因，由于过多的异源基因表达可能会导致细胞自身代谢的紊乱，影响细胞的正常生长代谢。
技术实现思路
为避免代谢途径过长可能导致的细胞自身代谢紊乱的问题，本专利技术提出利用可再生资源葡萄糖为原料，通过缩短MVA途径的反应步骤，完成生物催化剂的制备，构建了具有简短的异戊二烯代谢途径的基因工程菌。本专利技术所采取的技术方案如下:—种产异戊二烯的基因工程菌，是在微生物中共表达乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油酸水合酶的基因得到的重组菌。所述基因工程菌的宿主菌是大肠杆菌E.coli BL21 (DE3);所述表达乙酰辅酶A酰基转移酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因是乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBank登录序列号为AAG02438 ;所述表达3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶的基因是3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，GenBank登录序列号为AAG02439;所述表达末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶的基因是末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT, GenBank登录序列号为ADW41779.1 ;所述表达油酸水合酶的基因是油酸水合酶基因OhydEM, GenBank 登录序列号为 ACT54545.1。本专利技术还提供了一种利用所述基因工程菌生物合成异戊二烯的方法，是通过化学合成或克隆获得含有乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶基因OhydEM，构建含有上述基因的重组菌，再利用重组菌发酵生产异戊二烯。具体地，本专利技术利用所述基因工程菌生物合成异戊二烯的方法步骤如下:I)分别克隆或化学合成乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因，末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因和油酸水合酶；2)将步骤I)所得的基因连接到表达载体上，获得重组质粒；3)将步骤2)所得的重组质粒转化到宿主菌，获得重组菌；4)利用步骤3)所得重组菌，发酵生产异戊二烯。所述方法步骤I)中所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE, GenBank登录序列号为AAG02438。所述方法步骤I)中所述 3-轻-3甲基戍二酰辅酶A合酶基因mvaS,GenBank登录序列号为AAG02439。所述方法步骤I)中所述末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT，GenBank登录序列号为 ADW41779.1。所述方法步骤I)中所述油酸水合酶基因OhydEM, GenBank登录序列号为ACT54545.1。所述利用基因工程菌生物合成异戊二烯的方法的具体步骤如下:I)分别化学合成乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶OhydEM，并分别与载体pGH连接；2)将步骤I)所得的含有基因mvaE和基因mvaS的pGH载体与pACYDuet-Ι载体重组后获得重组质粒pACY-mvaE-mvaS ;将步骤I)所得的含有基因OleT和基因OhydEM的pGH载体与pCOLADuet-Ι载体重组后获得重组质粒pC0LA-01eT_0hydEM ；3)将步骤2)中所得的重组质粒pACY-mvaE-mvaS和pC0LA-01eT-0hydEM转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组菌；4)利用步骤3)所得重组菌发酵生产异戊二烯。在本专利技术的另一方面，提供了本专利技术的基因工程菌在生产异戊二烯中的应用。本领域技术人员应该理解，为在重组细胞中更好地表达，上述各种酶的基因序列或由其衍生的编码具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以根据所用的宿主细胞的密码子偏好性进行密码子优化。本领域技术人员还应该理解，上述各种酶的基因序列或由其衍生的编码具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以按照常规分子克隆技术克隆到宿主细胞中。另外，这些核苷酸片段还可以与适当的表达控制元件(例如，启动子，增强子等)可操作地连接。这些都在本领域技术人员的能力范围之内。这些核苷酸片段可操作性连接可以借助于接头也可以不用接头，这可以由本领域技术人员根据实际需要进行适当的选择。本领域技术人员还应该理解，在选择适当的宿主细胞构建好能够从乙酰辅酶A合成α-或β_菔烯的重组细胞后，本领域技术人员能够根据技术常识或经过有限次实验确定合适的培养条件(例如，发酵培养的温度、搅拌速度、PH值、溶氧率、发酵时间等参数)，也能够选择合适的诱导剂，确定加入诱导剂的时机，等等。本专利技术的有益效果:本专利技术所提供的方法大大缩短了大肠杆菌外源MVA途径的反应过程，以乙酰辅酶A作为原料合成异戊二烯只需要5步反应，仅涉及5种酶，避免了由于过多外源基因的表达而导致的对细胞自身代谢的影响，最终在大肠杆菌中构建生物基异戊二烯合成途径。提供的生物合成异戊二烯新方法大大缩短了工程大肠杆菌利用外源途径合成异戊二烯的反应过程，具有重要的社会意义和有益效果。【附图说明】图1是利用乙酰辅酶A生物合成异戊二烯代谢途径示意图。图2是pFHR-Ι质粒图谱。图3是pFHR-2质粒图谱。图4是pFHR-3质粒图谱。图5是异戊二烯标准品与发酵产物异戊二烯的GC-MS分析图谱。图6显示IPTG浓度对工程菌产异戊二烯的影响。 图7显示诱导温度对工程菌产异戊二烯的影响。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产异戊二烯的基因工程菌，其特征在于，是在微生物中共表达乙酰辅酶A酰基转移酶、3‑羟‑3甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油酸水合酶的基因得到的重组菌。

【技术特征摘要】
1.一种产异戊二烯的基因工程菌，其特征在于，是在微生物中共表达乙酰辅酶A酰基转移酶、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶和油酸水合酶的基因得到的重组菌。2.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌为大肠杆菌E.coli BL2KDE3);所述表达乙酰辅酶A酰基转移酶和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的基因是乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，GenBank登录序列号为AAG02438 ;所述表达3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶的基因是3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，GenBank登录序列号为AAG02439 ;所述表达末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶的基因是末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT，GenBank登录序列号为ADW41779.1 ;所述表达油酸水合酶的基因是油酸水合酶基因OhydEM，GenBank登录序列号为ACT54545.1。3.一种利用权利要求1所述基因工程菌生物合成异戊二烯的方法，其特征在于，通过化学合成或克隆获得含有乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS、末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因OleT和油酸水合酶基因OhydEM，构建含有上述基因的重组菌，再利用重组菌发酵生产异戊二烯。4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤如下: O分别克隆或化学合成乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因，3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶基因，末端烯烃形成脂肪酸脱羧酶基因和油酸水合酶； 2)将步骤I)所得的基因连接到表达载体上，获得重组质粒； 3)将步骤2)所...

【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，杨建明，邹慧斌，冯红茹，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37