本发明专利技术公开了一株稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌，该菌株于2014年06月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.9286。本发明专利技术所述的工程菌是通过将嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的copBAf基因整合到嗜酸性氧化硫硫杆菌的基因组上获得。本发明专利技术还公开了所述工程菌在生物浸矿中的应用。实验证实，本发明专利技术的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌较野生型嗜酸性氧化硫硫杆菌具有更高的抗铜特性，且遗传稳定，预示在铜矿的生物浸出领域具有很大的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
一株嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌及其应用
本专利技术涉及一株嗜酸性氧化硫硫杆菌及其应用，尤其涉及一株能够稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜工程菌及其在生物浸矿中的应用。
技术介绍
嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillusthiooxidans, A.thiooxidans)在生物浸矿、重金属污染治理和生物脱硫等领域具有十分重要的作用，但是在生物浸出和重金属污染治理过程中，尤其是在铜矿的生物浸出过程中，铜离子浓度往往很高，一般为30~90mM,有些浸矿环境中甚至高达300mM,而A.thiooxidans的铜离子最小抑制浓度(MIC)通常低于上述环境中的铜离子浓度，例如，本实验保藏的A.thiooxidans ATCC19377的铜离子MIC约为25mM远低于浸矿环境中的铜离子浓度，因此限制了其应用范围。目前,在嗜酸性硫杆菌属(Acidithiobacillus sp.)中，科研工作者仅通过导入重组质粒的形式来提高或增加该属菌的某些生物特性；但是以质粒形式构建的基因工程菌稳定性差，在无抗生素压力下，工程菌中的质粒容易丢失，从而使得工程菌中某种生物特性降低甚至丧失，因此，为了提高工程菌中质粒的稳定性，必须在其生存的环境中添加抗生素；嗜酸性硫杆菌主要应用于生物浸矿、重金属污染治理等领域，向上述环境中添加抗生素一方面会对环境造成危害，另一方面价格不菲的抗生素无疑会增加工业成本，不利于该种基因工程菌的大规模应用。如果将某些具有特殊生物活性的基因通过遗传操作的方法整合到嗜酸性硫杆菌的染色体上将会克服上述弊端。经对国内外文献的检索，目前还没有任何有关通过基因整合的方法构建能够稳定遗传的嗜酸性硫杆菌基因工程菌的报道，尤其是通过基因整合的方法构建能够稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌高铜抗性基因工程菌的报道，基于此，构建能够稳定遗传的A.thiooxidans高抗铜基因工程菌是当下亟待解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术中对嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜能力遗传改良方法的空白，本专利技术的目的是提供一株能够稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜工程菌及其应用。本专利技术所述稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌，其特征在于:所述菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf,该菌株已于2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC N0.9286。本专利技术所述稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌的构建方法，步骤是:(I)从嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)ATCC23270 基因组上PCR扩增含有启动子的铜离子外排P型ATPase基因copBAf，构建到嗜酸性氧化硫硫杆菌整合型质粒PZK19-1ngUH-1ngDH上获得重组质粒pZK19-COpBAf，利用转化方法将该重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli) S17-1 λ pir中；(2)以野生型A.thiooxidans ATCC19377菌株作为受体菌，含重组质粒pZK19-copBAf的大肠杆菌E.coli S17-1 λ pir作为供体菌，通过接合转移的方法将含有copBAf基因的整合型质粒pZK19-copBAf转入嗜酸性氧化硫硫杆菌菌株ATCC19377中；将接合菌液稀释后涂布到含150 μ g/mL卡那霉素的Starkey-Na2S2O3固体平板上，30°C培养10天长出单菌落；将1.0 μ L12mg/mL的无菌X_gal溶液滴加单菌落上，生成的蓝色单菌落即是筛选获得的copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株,通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证确认；(3)以copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株作为受体菌，含pMSDl-PTScel质粒的E.coli SMlO作为供体菌，通过接合转移的方法将诱导质粒pMSDl-PTScel转入copBAf基因整合的A.thiooxidans单交换菌株中；将接合菌液稀释后涂布到含12mg/mL X_gal溶液和150 μ g/mL链霉素的Starkey-Na2S2O3固体平板上，30°C培养10天获得发生第二次同源重组的白色单菌落；挑取白色菌落进行菌落PCR筛选获得A.thiooxidans copBAf基因整合的基因工程菌，该菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf。本专利技术所述的稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌在生物浸矿中的应用。其中:嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌铜离子MIC的测定方法是:将嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf 菌株在 Starkey_S° 液体培养基中，300C，180rpm摇瓶培养至对数后期(约5~7天)，按照菌浓为IO6~IO7个/mL的接种量将 A.thiooxidans copBAf 接种到 10OmT,含 O ~IOOmM CuSO4 的 Starkey_S° 液体培养基中，300C，180rpm摇瓶培养；培养期间2或3天从每瓶菌中取ImL菌悬液用于测定0D_，并绘制A.thiooxidans (3<^1^在不同铜离子浓度培养下的生长曲线,确定A.thiooxidans (3<^1^菌株的铜尚子MIC。由A.thiooxidans copBAf菌株的在不同铜离子浓度下的生长曲线可以看出该菌的铜离子MIC大于80mM，并且浸矿环境中的铜离子浓度通常为30_90mM，提示，该菌株的高铜抗性将有利于其在生物浸出中的应用。其中:所述嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌用于生物浸矿的方法是:(I)嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf在铜矿粉中的驯化:将嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf 菌株在 Starkey-S0液体培养基中，30°C，180rpm摇瓶培养至对数后期(约5~7天)，按照菌浓为IO6~IO7个/mL的接种量将A.thiooxidans copBAf接种至Ij 200mL含2% (W/V)黄铜矿矿粉(粒径<0.20mm)和1% (W/V)硫粉的Starkey-S0液体培养基中，30°C，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0~6.0X IO8个/mL ;将在2% (W/V)黄铜矿矿粉下生长的A.thiooxidans copBAf接种到200mL含4% (W/V)黄铜矿矿粉和I % (W/V)硫粉的Starkey_S°液体培养基中，30°C,180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0~6.0X IO8个/mL ;将在4% (W/V)黄铜矿矿粉下生长的A.thiooxidans copBA.f接种到200mL含5% (W/V)黄铜矿矿粉和1% (W/V)硫粉的Starkey-Sci液体培养基中，30°C，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.0~6.0 X IO8个/mL。(2)嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidith本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌，其特征在于：所述菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copBAf，该菌株已于2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.9286。
【技术特征摘要】
1.一株稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌，其特征在于:所述菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copBAf,该菌株已于2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCN0.9286。2.权利要求1所述稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌的构建方法，步骤是: (1)从嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)ATCC23270 基因组上PCR扩增含有启动子的铜离子外排P型ATPase基因copBAf，构建到嗜酸性氧化硫硫杆菌整合型质粒PZK19-1ngUH-1ngDH上获得重组质粒pZK19-COpBAf，利用转化方法将该重组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli) S17-1 λ pir中； (2)以野生型A.thiooxidans ATCC19377菌株作为受体菌，含重组质粒pZK19_copBAf的大肠杆菌E.coli S17-1 λ pir作为供体菌，通过接合转移的方法将含有copBAf基因的整合型质粒pZK19-copBAf转入嗜酸性氧化硫硫杆菌菌株ATCC1...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘相梅，文晴，林建群，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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