一种阳性脂质体DOTAP的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，包括(±)‑DOTAP,(S)‑DOTAP,(R)‑DOTAP的制备方法。本发明专利技术采用廉价的3‑氯‑1,2‑丙二醇为起始物，通过两步法合成DOTAP产品，经硅胶柱纯化可获得高纯度的阳性脂质体DOTAP。本发明专利技术提供了一种成本低廉且工序简单的DOTAP制备方法，该方法涉及的原料成本低，反应条件温和，同时后处理简单，无需离子交换工序，具有经济、环保、高效性。

Preparation of a positive liposome DOTAP

The invention discloses a preparation method of a positive liposome DOTAP, which comprises the preparation method of (+) DOTAP, (S) DOTAP, (R) DOTAP. In this invention, a cheap 3 chlorinated 1,2 propylene glycol was used as the starting substance, and the DOTAP product was synthesized by the two step method. The high purity positive liposome DOTAP could be obtained by the silica gel column purification. The invention provides a low cost and simple process for the preparation of DOTAP. The method involves low cost of raw materials, mild reaction conditions, simple post treatment, no ion exchange process, and economic, environmental and high efficiency.

【技术实现步骤摘要】
一种阳性脂质体DOTAP的制备方法
本专利技术属于药物合成领域，具体涉及一种阳性脂质体DOTAP的制备方法。
技术介绍
阳性脂质体作为一种高效的基因传递载体，通过将核酸特异性地传递到靶细胞中，达到将外源基因导入真核细胞的目的，其基因转染率高，离体细胞可以瞬间表达外源基因，在基因治疗方面有广泛而独特的应用。DOTAP是一种常用的阳离子脂质体,全称为2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵，具有生物惰性，可生物降解，无毒，无免疫原性，它与核酸能形成稳定的转染复合物进入细胞，并将核酸释放到细胞内，而自身不会对机体造成损伤，因此常被用作真核细胞转染剂和DNA疫苗的载体。CN105920599A报道阳性脂质体DOTAP是一种良好的佐剂，与蛋白质抗原形成一种胶束膜疫苗，既可诱导体液免疫应答，又可诱导细胞免疫应答。CN102133404A报道阳性脂质体DOTAP可用作肿瘤靶向治疗药物的载体，DOTAP可与卵磷脂组成一种新型脂质体，这种新型质体与生物活性物质形成稳定的复合物，从而将活性物质定向、高效地携带到人体内部的靶细胞内，达到输送药物的目的。然而，目前阳性脂质体DOTAP的制备方法成本高昂，制备工艺复杂，反应时间长，安全隐患高。US5264618报道了一种制备DOTAP消旋体的方法，该方法是通过氯甲烷对二甲基氨基化合物进行甲基化反应制备，反应条件为30℃，恒定绝对压力为1200mbar，反应137小时。该方法所用的氯甲烷为易燃、易爆气体，且需要高压密封，反应长达5.7天。此反应条件苛刻，设备要求高，反应时间长，安全隐患高且环境不友好。DE4013632A1中概述了DOTAP的一种合成方法，该方法是在氯仿/甲醇/HCl水溶剂系统中进行DOTAP溴化物的离子交换，然后借助色谱柱纯化。DOTAP溴化物是预先从1-溴-2,3-二油酰氧基丙烷制得。该方法的制备成本高昂且离子交换工序繁琐。Leventis和Silvius在Biochim.Biophys.Acta中报道了DOTAP的一种合成方法，在两相溶剂/NaCl溶液系统中进行DOTAP碘化物的离子交换。DOTAP碘化物是通过碘甲烷甲基化相应的二甲氨基化合物而制得。该方法用到剧毒的碘甲烷气体且离子交换工序繁琐，环境不友好且制备成本高。以上报道的合成方法反应条件苛刻，且用到大量易燃、易爆且剧毒的气体，反应操作及后处理工序繁琐，制备成本高昂。
技术实现思路
本专利技术目的在于：针对上述存在的问题，本专利技术提供了一种成本低廉且工序简单的DOTAP制备方法，该方法涉及的原料成本低，反应条件温和，同时后处理简单，无需离子交换工序，具有经济、环保、高效性。本专利技术采用的技术方案如下：一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，以3-氯-1,2-丙二醇为基础物质，以三甲胺、油酸为中间反应物来合成DOTAP，所述3-氯-1,2-丙二醇中的氯可以用F，Br，I，HSO4-，H2PO4-替代。具体包括以下步骤：步骤一：制备2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵：将3-氯-1,2-丙二醇加入单口瓶中，再加入30％的三甲胺和溶剂，升温至20-100℃，保温搅拌6-20h至原料3-氯-12-丙二醇,反应完全。降温至20℃，用乙酸乙酯洗涤反应液3-5次，收集滤液并在60-70℃减压浓缩至干得类白色固体，即为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵。步骤二：制备DOTAP：向氮气置换后的250mL的单口瓶中先后加入步骤一所得产物和缩合剂、碱、溶剂和油酸，反应体系在0-30℃下保温4-16h至反应完全。向体系中加入水使固体析出，过滤收集到的固体，所得滤饼即为DOTAP粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体，即为DOTAP。步骤三：将上述步骤得到的DOTAP进行真空冷冻干燥，干燥条件：-10--30℃，干燥12-20h，得到干燥的DOTAP。所述步骤一中所述3-氯-1,2-丙二醇包括：(±)-3-氯-12-丙二醇，(S)-3-氯-12-丙二醇，(R)-3-氯-12-丙二醇中的一种；所述溶剂包括水，甲醇，乙醇，异丙醇，丙酮，四氢呋喃或乙醚中的至少一种。所述步骤一中所述三甲胺包括三甲胺气体，三甲胺水溶液，三甲胺四氢呋喃溶液，三甲胺丙酮溶液或三甲胺醇溶液中的至少一种，优选三甲胺水溶液；所述三甲胺使用当量为3-氯-1,2-丙二醇的1.5-5.0倍，优选3.0倍。所述步骤二中所述缩合剂为HATU、HBTU、HOBT、HOAT、DCC或EDCl中的至少一种，优选EDCl，缩合剂的使用当量为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的1.0-3.0倍。所述步骤二中所述碱为常用有机碱，包括DMAP,DIPEA,三乙胺或吡啶中的至少一种，优选DMAP，碱的使用当量为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的0.5-3.0倍，优选0.5倍；所述溶剂为DMF和DMSO中的至少一种，优选DMF。所述步骤二还可通过下面的方式实现：向250mL单口瓶中加入油酸和二氯甲烷，然后逐滴滴加二氯亚砜，滴加完后0-30℃保温4-16h至反应完全，浓缩反应液除去未反应的二氯甲烷和二氯亚砜，得油酰氯。向氮气置换后的单口瓶中先后加入2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵，碱，溶剂，0-5℃下滴加油酰氯，滴加完毕反应体系升温至20-30℃搅拌9h至反应完全，向体系加水使固体析出，过滤固体即得粗品，经硅胶柱纯化得DOTAP。所述氯化亚砜的使用当量为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵使用当量的1.5-2.0倍，优选1.5倍；所述碱为常用有机碱，包括DMAP,DIPEA,三乙胺或吡啶中的至少一种，优选三乙胺，碱的使用当量为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的0.5-3.0倍，优选3.0倍；所述溶剂为DMF和DMSO中的至少一种，优选DMF。综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，该方法实现的成本低，反应条件温和，同时后处理简单，无需离子交换工序，具有经济、环保、高效的优点。附图说明本专利技术将通过例子并参照附图的方式说明，其中：图1是中间产物2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成路线，其中X＝F,Cl，Br，I，HSO4-，H2PO4-。图2是终产物DOTAP的合成路线。具体实施方式本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。实施例1外消旋DOTAP的制备:(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵的合成在500mL单口瓶中加入50.00g(±)-3-氯-1，2-丙二醇(0.452mol)，178.00g30％三甲胺水溶液(0.904mol)和50mL水，然后升温至90℃，保温搅拌16h使原料3-氯-1,2-丙二醇反应完全。降温至20℃，反应液用乙酸乙酯洗涤三次(100mL×3),收集水溶液并减压浓缩至干得类白色固体70.00g，收率91.2％，HPLC纯度93.40％。(±)-DOTAP的合成方法一向氮气置换后的250mL单口瓶中先后加入6.83g(±)-2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵(0.041mol)、23.20gEDCI(0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于：以3‑氯‑1,2‑丙二醇为基础物质，以三甲胺、油酸为中间反应物来合成DOTAP。

【技术特征摘要】
1.一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于：以3-氯-1,2-丙二醇为基础物质，以三甲胺、油酸为中间反应物来合成DOTAP。2.根据权利要求1所述的一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于，所述3-氯-1,2-丙二醇中的氯可以用F，Br，I，HSO4-，H2PO4-替代。3.根据权利要求2所述的一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：制备2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵：将3-氯-1,2-丙二醇加入单口瓶中，再加入30％的三甲胺和溶剂，升温至20-100℃，保温搅拌6-20h至原料3-氯-12-丙二醇,反应完全。降温至20℃，用乙酸乙酯洗涤反应液3-5次，收集滤液并在60-70℃减压浓缩至干得类白色固体，即为2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵。步骤二：制备DOTAP：向氮气置换后的250mL的单口瓶中先后加入步骤一所得产物和缩合剂、碱、溶剂和油酸，反应体系在0-30℃下保温4-16h至反应完全。向体系中加入水使固体析出，过滤收集到的固体，所得滤饼即为DOTAP粗品。该粗品经硅胶柱纯化得白色固体，即为DOTAP。步骤三：将上述步骤得到的DOTAP进行真空冷冻干燥，干燥条件：-10--30℃，干燥12-20h，得到干燥的DOTAP。4.根据权利要求3所述的一种阳性脂质体DOTAP的制备方法，其特征在于，所述步骤二还可通过下面的方式实现：向250mL单口瓶中加入油酸和二氯甲烷，然后逐滴滴加二氯亚砜，滴加完后0-30℃保温4-16h至反应完全，浓缩反应液除去未反应的二氯甲烷和二氯亚砜，得油酰氯。向氮气置换后的单口瓶中先后加入2,3-二羟基丙基三甲基氯化铵，碱，溶剂，0-5℃下滴加油酰氯，滴加完毕反应体系升温至20-30℃搅拌9h至反应完全，向体系加水使固体析出，过滤固体即得粗品，经...

【专利技术属性】
技术研发人员：温万东，丁刚，胡志鹏，程睿，郭鹏，
申请(专利权)人：爱斯特成都生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51