一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法技术

本发明专利技术公开一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，属于遗传工程技术领域。本发明专利技术首次建立了一种牛筋草的遗传转化体系方法，包括愈伤组织的诱导和继代、转化、诱导分化、生根筛选培养和炼苗移栽、转基因植株的PCR检测等步骤。该方法优点在于：(1)愈伤组织诱导率高，为遗传转化提供了大量的受体材料。(2)经过采用压力筛选培养基对抗性愈伤进行筛选和GUS鉴定对抗性植株进行筛选，简化了实验过程，大大减少了转化后的工作量。(3)利用传统的单子叶遗传转化方法，获得了稳定、高效的一种牛筋草遗传转化体系方法。

【技术实现步骤摘要】
一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法
本专利技术属于遗传工程
，更具体涉及一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法。
技术介绍
牛筋草(Eleusineindica)是禾本科一年生杂草，不仅分布广泛、适应能力强的特点，而且具有强的繁殖能力、分蘖能力强，已成为世界十大恶性杂草之一。由于除草剂的长期大量使用，目前已有265种杂草对15类除草剂产生了抗药性，而牛筋草已对7类除草剂产生了多重抗性。近年来，遗传转化法为抗病虫草害的研究提供了重要的技术手段。迄今为止，有关牛筋草遗传转化体系的研究还未曾报道，这大大地限制了牛筋草抗药性研究的发展。所以，建立一种稳定、高效的牛筋草遗传转化体系，是研究牛筋草抗药性遗传机理的重要的方法手段。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法。该方法高效稳定，以成熟的敏感型牛筋草种子为外植体，建立其遗传转化体系。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，包括如下步骤：(1)愈伤组织的诱导和继代：牛筋草种子去皮，-20℃冷冻20～30d后，于75％酒精浸泡，用0.05％～0.2％HgCl2消毒灭菌10～20min后，在无菌条件下，用无菌水反复清洗，风干，接入诱导培养基IC中；30～40d后，将产生的愈伤组织转入继代培养基AC中进行继代培养，每30～40d继代一次，继代2～3次；再进行预培养3～4d，选取淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤组织作为后续的材料；培养条件：25±2℃、24h黑暗。(2)转化：将步骤(1)预培养得到的胚性愈伤组织低温处理后，接入OD600＝0.4～0.6的目的农杆菌悬浮液中，“二次间歇抽真空”浸染，使农杆菌充分吸附到外植体上；将感染后的愈伤组织移至灭菌滤纸上，吸去表面液体后转入共培养培养基CC上，进行共培养2～3d；取出共培养后的愈伤组织，脱菌、风干后转入筛选培养基SC1中筛选，30～40d后转入筛选培养基SC2上筛选；培养条件：25℃±2℃、24h黑暗培养。(3)诱导分化：将步骤(2)筛选培养得到的愈伤组织，转接到分化培养基DC中，进行分化培养。(4)生根筛选培养和炼苗移栽：待不定芽长到4～6cm时，转入生根筛选培养基RC中；待幼苗根系发达时，炼苗，洗净根部琼脂凝胶，剪取转基因苗叶片和根部大约2～4cm，进行牛筋草组织GUS染色，将阳性苗移至基质中，12h光照培养。(5)转基因植株的PCR检测：提取步骤(4)得到的阳性苗的基因组DNA，针对目的基因设计引物，采用PCR技术鉴定是否可扩增出目的基因片段，若鉴定成功，即得到牛筋草转基因植株。所述的诱导培养基IC：N6+0.5～2mg·L-12,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1。优选的，所述的诱导培养基IC：N6+0.5～1mg·L-12,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1。更优选的，所述的诱导培养基IC：N6+0.5mg·L-12,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1。所述的继代培养基AC：N6+0.25～1mg·L-12,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+3～4g·L-1植物凝胶+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1；优选的，所述的继代培养基AC：N6+0.25～0.5mg·L-12,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+3～4g·L-1植物凝胶+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1；更优选的，所述的继代培养基AC：N6+0.25mg·L-12,4-D+0.8g·L-1水解酪蛋白+3g·L-1植物凝胶+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1；所述的预培养所用的培养基同继代培养基AC。所述的共培养培养基CC：诱导培养基IC+100～300μmol·L-1乙酰丁香酮AS，pH＝5.2±0.1。优选的，所述的共培养培养基CC：诱导培养基IC+300μmol·L-1乙酰丁香酮AS，pH＝5.2±0.1。所述的筛选培养基SC1：诱导培养基IC+25～30mg·L-1潮霉素+300～400mg·L-1羧苄青霉素，pH＝6.0±0.1；优选的，所述的筛选培养基SC1：诱导培养基IC+30mg·L-1潮霉素+300mg·L-1羧苄青霉素，pH＝6.0±0.1；所述的筛选培养基SC2：诱导培养基IC+15～20mg·L-1潮霉素+200～300mg·L-1羧苄青霉素；pH＝6.0±0.1。优选的，所述的筛选培养基SC2：诱导培养基IC+15mg·L-1潮霉素+200mg·L-1羧苄青霉素；pH＝6.0±0.1。所述的分化培养基DC：MS+0.5～2mg·L-16-BA+0.5～2mg·L-1KT+0～0.2mg·L-1NAA+0～0.2mg·L-1IAA+0～200mg·L-1羧苄青霉素+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝6.0±0.1。优选的，所述的分化培养基DC：MS+0.5mg·L-16-BA+0.5mg·L-1KT+0.05mg·L-1NAA+0.05mg·L-1IAA+200mg·L-1羧苄青霉素+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂，pH＝6.0±0.1。所述的生根筛选培养基RC：1/2MS+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂+25～30mg·L-1潮霉素，pH＝5.8±0.1。优选的，所述的生根筛选培养基RC：1/2MS+30g·L-1蔗糖+8g·L-1琼脂+30mg·L-1潮霉素，pH＝5.8±0.1。步骤(1)中所述的消毒优选为用0.05％HgCl2消毒灭菌10min。步骤(2)中所述的低温处理为4℃静置处理20～40min；优选为4℃静置处理30min；步骤(2)中所述的目的农杆菌为质粒pCAMBIA1305.1插入根癌农杆菌得到的；所述的目的农杆菌为通过含有目的基因的农杆菌双元表达载体导入根癌农杆菌中的。所述的目的基因为GUS基因；所述的表达载体为pCAMBIA1305.1，由华南农业大学林学院提供，且是常规市售载体。所述的根癌农杆菌为根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105，由华南农业大学农学院提供。所述的目的农杆菌悬浮液是通过YEB培养基培养得到。所述的YEB培养基：牛肉膏酵母粉5g·L-1+酵母粉1g·L-1+蛋白胨5g·L-1+蔗糖5g·L-1+MgSO4·7H2O为0.5g·L-1+15g·L-1琼脂，pH＝7.0±0.1。步骤(2)中所述的“二次间歇抽真空”浸染为抽真空10min+静置5min+抽真空10min+静置5min；步骤(4)中所述的基质为土壤：沙子：营养土＝2:2:1。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及效果：本专利技术首次建立了一种牛筋草的遗传转化体系方法，其优点在于(1)愈伤组织诱导率高，为遗传转化提供了大量的受体材料。(2)经过采用压力筛选培养基对抗性愈伤进行筛选和GUS鉴定对抗性植株进行筛选，简化了实验本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤：(1)愈伤组织的诱导和继代：牛筋草种子去皮，‑20℃冷冻20～30d后，于75％酒精浸泡，用0.05％～0.2％HgCl2消毒灭菌10～20min后，在无菌条件下，用无菌水反复清洗，风干，接入诱导培养基IC中；30～40d后，将产生的愈伤组织转入继代培养基AC中进行继代培养，每30～40d继代一次，继代2～3次；再进行预培养3～4d，选取淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤组织作为后续的材料；培养条件：25±2℃、24h黑暗；(2)转化：将步骤(1)预培养得到的胚性愈伤组织低温处理后，接入OD600＝0.4～0.6的目的农杆菌悬浮液中，“二次间歇抽真空”浸染，使农杆菌充分吸附到外植体上；将感染后的愈伤组织移至灭菌滤纸上，吸去表面液体后转入共培养培养基CC上，进行共培养2～3d；取出共培养后的愈伤组织，脱菌、风干后转入筛选培养基SC1中筛选，30～40d后转入筛选培养基SC2上筛选；培养条件：25℃±2℃、24h黑暗培养；(3)诱导分化：将步骤(2)筛选培养得到的愈伤组织，转接到分化培养基DC中，进行分化培养；(4)生根筛选培养和炼苗移栽：待不定芽长到4～6cm时，转入生根筛选培养基RC中；待幼苗根系发达时，炼苗，洗净根部琼脂凝胶，剪取转基因苗叶片和根部2～4cm，进行牛筋草组织GUS染色，将阳性苗移至基质中，12h光照培养；(5)转基因植株的PCR检测：提取步骤(4)得到的阳性苗的基因组DNA，针对目的基因设计引物，采用PCR技术鉴定是否扩增出目的基因片段，若鉴定成功，即得到牛筋草转基因植株。...

【技术特征摘要】
1.一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤：(1)愈伤组织的诱导和继代：牛筋草种子去皮，-20℃冷冻20～30d后，于75％酒精浸泡，用0.05％～0.2％HgCl2消毒灭菌10～20min后，在无菌条件下，用无菌水反复清洗，风干，接入诱导培养基IC中；30～40d后，将产生的愈伤组织转入继代培养基AC中进行继代培养，每30～40d继代一次，继代2～3次；再进行预培养3～4d，选取淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤组织作为后续的材料；培养条件：25±2℃、24h黑暗；(2)转化：将步骤(1)预培养得到的胚性愈伤组织低温处理后，接入OD600＝0.4～0.6的目的农杆菌悬浮液中，“二次间歇抽真空”浸染，使农杆菌充分吸附到外植体上；将感染后的愈伤组织移至灭菌滤纸上，吸去表面液体后转入共培养培养基CC上，进行共培养2～3d；取出共培养后的愈伤组织，脱菌、风干后转入筛选培养基SC1中筛选，30～40d后转入筛选培养基SC2上筛选；培养条件：25℃±2℃、24h黑暗培养；(3)诱导分化：将步骤(2)筛选培养得到的愈伤组织，转接到分化培养基DC中，进行分化培养；(4)生根筛选培养和炼苗移栽：待不定芽长到4～6cm时，转入生根筛选培养基RC中；待幼苗根系发达时，炼苗，洗净根部琼脂凝胶，剪取转基因苗叶片和根部2～4cm，进行牛筋草组织GUS染色，将阳性苗移至基质中，12h光照培养；(5)转基因植株的PCR检测：提取步骤(4)得到的阳性苗的基因组DNA，针对目的基因设计引物，采用PCR技术鉴定是否扩增出目的基因片段，若鉴定成功，即得到牛筋草转基因植株。2.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：所述的诱导培养基IC：N6+0.5～2mg·L-12,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1。3.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：所述的继代培养基AC：N6+0.25～1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，沈雪峰，杨九铃，董朝霞，魏吉平，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44