制备生理活性多肽缀合物的方法技术

提供的是一种制备生理活性多肽缀合物的方法，其中，生理活性多肽和非肽基聚合物经由共价键彼此连接。所述方法通过改善所述非肽基聚合物与所述生理活性多肽的反应来改善生理活性多肽缀合物的总产率；并且特别地，所述方法通过经选择性沉淀进行两步反应以高产率制备生理活性多肽缀合物。本发明专利技术的制备方法用来以高产率产生非肽基聚合物‑生理活性多肽缀合物和生理活性多肽‑生理活性载体缀合物，并且因此，所述方法可用于开发保持相对高水平的体内活性且具有显著增加的血液半衰期的多种肽药物的长效制剂。

Preparation of physiological active polypeptide conjugates

The invention provides a method for preparing physiologically active polypeptide conjugates, wherein physiologically active peptides and non peptidyl polymers are linked to each other through covalent bonds. The method improves the total yield of the physiological active polypeptide conjugate by improving the reaction of the peptide based polymer and the physiological active polypeptide; and in particular, the method is prepared by two steps of selective precipitation to prepare the physiological active polypeptide conjugate at a high yield rate. The preparation method of the present invention is used to produce conjugates of physiological active polypeptide conjugates of non peptide polymers and physiological active peptides at high yield, and therefore, the method can be used to develop a long effect system of peptide drugs that maintain relatively high level of body activity and have significantly increased blood half life. Agent.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备生理活性多肽缀合物的方法
本专利技术涉及制备生理活性多肽缀合物的方法，其中，生理活性多肽和非肽基聚合物经由共价键彼此连接。所述方法通过改善所述非肽基聚合物与所述生理活性多肽的反应来改善生理活性多肽缀合物的总产率；并且特别地，所述方法通过经选择性沉淀进行两步反应以高产率制备生理活性多肽缀合物。
技术介绍
肽由于它们的低稳定性倾向于容易变性，并通过体内蛋白水解酶降解，因此丢失活性。肽具有相对小的尺寸，并且由此容易地通过肾。因此，为了保持包括肽作为药学活性成分的药物的血液水平和效力，必需要向患者频繁施用肽药物。然而，肽药物通常以可注射制剂的形式施用，并且为保持生理活性肽的血液水平的这种频繁的施用导致患者的严重疼痛。已经进行许多尝试来解决这些问题，包括通过藉由增加肽药物的生物膜渗透性进行口服或鼻吸入将肽药物递送至体内；修饰对蛋白酶敏感的特定氨基酸序列以稳定肽并防止被蛋白酶降解(例如，修饰GLP-l氨基酸序列以防止因为二肽基肽酶失去效力等)；将具有高可溶性的聚合物材料如聚乙二醇(PEG)化学添加至肽的表面；和使用重组融合技术制备生理活性多肽和人血清白蛋白或免疫球蛋白片段(Fc)的融合蛋白。然而，融合蛋白的制备的问题在于，聚合物与生理活性肽的非特异性结合阻断肽的活性结构域，从而减少肽的活性，并且因此防止非特异性结合的位点特异性结合减少制剂产率或需要对生理活性肽的人工操作。为了解决没有效率地制备生理活性多肽和非肽基聚合物的缀合物的问题，已经尝试使用非肽基聚合物修饰生理活性多肽缀合物中的生理活性多肽的特定部位(韩国专利No.10-1164453)。此外，在通过使用具有两个官能团的非肽基聚合物制备生理活性多肽和人血清白蛋白或免疫球蛋白片段(Fc)的融合蛋白时，已经尝试了许多方法来增加制剂产率。本专利技术的专利技术人已经继续了他们的研究，并且他们已经发现，在非肽基聚合物和生理活性多肽之间的第一次缀合反应后，通过选择性沉淀来分离未反应的(未缀合的)生理活性多肽，然后使其经过第二次反应以高产率和高纯度产生非肽基聚合物-生理活性多肽缀合物，并且使用该缀合物以高产率和高纯度产生生理活性多肽-生理活性载体缀合物，由此完成本专利技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是提供制备生理活性多肽缀合物的方法，该方法包括：1)从反应混合物中选择性地沉淀未缀合至非肽基聚合物的生理活性多肽，所述反应使所述非肽基聚合物缀合至生理活性多肽的氨基酸残基；和2)在步骤1)的缀合反应下使从所述沉淀回收的生理活性多肽与所述非肽基聚合物反应。本专利技术的另一个目的是提供制备生理活性多肽和生理活性载体的缀合物的方法，所述方法包括经由共价键缀合，如上所述制备的生理活性多肽缀合物与生理活性载体以制备多肽-载体缀合物，其中，在所述多肽-载体缀合物中，使所述非肽基聚合物的两端分别缀合至所述生理活性载体和生理活性多肽。问题的解决方案为了实现上述目的，本专利技术的一方面提供了制备生理活性多肽缀合物的方法，所述方法包括：1)从反应混合物中选择性地沉淀未缀合至非肽基聚合物的生理活性多肽，所述反应使所述非肽基聚合物缀合至生理活性多肽的氨基酸残基；和2)在步骤1)的缀合反应下使从所述沉淀回收的生理活性多肽与所述非肽基聚合物反应。本专利技术的具体实施方式提供了制备方法，其中，溶解沉淀的生理活性多肽，然后使其缀合至所述非肽基聚合物。本专利技术的另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，基于所述混合物的总重，所述步骤1)中的反应混合物包括10重量％或更多的所述非肽基聚合物没有结合的生理活性多肽。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述步骤1)中的选择性沉淀使用有机溶剂进行。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述有机溶剂为异丙醇。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述步骤1)中的反应混合物使用反应混合物的体积的2体积或更多的异丙醇处理。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述步骤1)中的反应混合物使用反应混合物的体积的3至7体积的异丙醇处理。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，在步骤2)中，所述回收的生理活性多肽与所述非肽基聚合物反应0.5小时至4.0小时。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述生理活性多肽选自下组：胰岛素分泌肽、凝血因子、消化促进激素、胰岛素、胃泌酸调节素、胰高血糖素、肾上腺皮质激素、甲状腺激素、肠激素、细胞因子、酶、生长因子、神经肽、垂体激素、下丘脑激素、抗肥胖肽、抗病毒肽和具有生理活性的非天然肽衍生物。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述生理活性多肽选自下组：促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、胰淀素(amylin)、生长抑素、肽YY(PYY)、神经肽Y(NPY)、血管紧缩素、缓激肽、降钙素、促肾上腺皮质激素、章鱼素(eledoisin)、胃泌素、瘦素、催产素、加压素、黄体化激素(luteinizinghormone)、促黄体激素、促卵泡激素、甲状旁腺激素、分泌素、舍莫瑞林(sermorelin)、人生长激素(hGH)、生长激素释放肽、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、干扰素(IFN)、白细胞介素、催乳素释放肽、阿立新(orexin)、甲状腺释放肽、胆囊收缩素、胃泌素抑制肽、钙调蛋白、胃泌素释放肽、胃动素、血管活性肠肽、心房钠尿肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)、C型利钠肽(CNP)、神经激肽A、神经介肽、肾素、内皮缩血管肽、角蝰毒素肽、酪啡肽(carsomorphinpeptide)、皮啡肽、强啡肽、内啡肽、脑啡肽、T细胞因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体、尿激酶受体、肿瘤抑制剂、胶原酶抑制剂、胸腺生成素、胸腺肽(thymulin)、胸腺五肽、胸腺素(tymosin)、胸腺体液因子、肾上腺髓质素、咽侧体抑制素、淀粉样β蛋白片段、抗菌肽、抗氧化肽、铃蟾肽、骨钙素、CART肽、E-选择素、ICAM-1、VCAM-1、leucokine、Kringle-5、层粘连蛋白、抑制素、甘丙肽、纤连蛋白、胰抑素和恩夫韦肽(fuzeon)。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述生理活性多肽是毒蜥外泌肽(exendin)、胰岛素、毒蜥外泌肽衍生物、胰岛素衍生物或它们的组合。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述毒蜥外泌肽衍生物选自下组：脱氨基-组氨酰基(DA)-毒蜥外泌肽-4、β-羟基-咪唑并-丙酰基(HY)-毒蜥外泌肽-4、咪唑并-乙酰基(CA)-毒蜥外泌肽-4和二甲基-组氨酰基(DM)-毒蜥外泌肽-4。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，使所述非肽基聚合物缀合至毒蜥外泌肽或其衍生物的Lys27，所述毒蜥外泌肽是生理活性肽。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，使所述非肽基聚合物缀合至胰岛素或胰岛素类似物β链(其为生理活性多肽)或它们的衍生物的N末端。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所述非肽基聚合物选自下组：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物、脂质聚合物、壳多糖、透明质酸及它们的组合。本专利技术的又另外的具体实施方式提供了制备方法，其中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备生理活性多肽缀合物的方法，其包括：1)从反应混合物中选择性地沉淀未缀合至非肽基聚合物的生理活性多肽，所述反应使所述非肽基聚合物缀合至生理活性多肽的氨基酸残基；和2)在步骤1)的缀合反应下使从所述沉淀回收的生理活性多肽与所述非肽基聚合物反应。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.24 KR 10-2015-01053101.一种制备生理活性多肽缀合物的方法，其包括：1)从反应混合物中选择性地沉淀未缀合至非肽基聚合物的生理活性多肽，所述反应使所述非肽基聚合物缀合至生理活性多肽的氨基酸残基；和2)在步骤1)的缀合反应下使从所述沉淀回收的生理活性多肽与所述非肽基聚合物反应。2.权利要求1的方法，其中，步骤2)包括溶解沉淀的生理活性多肽，然后使所述多肽缀合至所述非肽基聚合物。3.权利要求1的方法，其中，基于所述反应混合物的总重，所述步骤1)中的反应混合物包含10重量％或更多的未缀合的生理活性多肽。4.权利要求1的方法，其中，所述步骤1)中的选择性沉淀使用有机溶剂进行。5.权利要求4的方法，其中，所述有机溶剂为异丙醇、乙醇、1-丙醇、1-丁醇、丙酮、乙腈或它们的组合。6.权利要求5的方法，其中，所述步骤1)中的反应混合物使用2至7体积的异丙醇处理。7.权利要求6的方法，其中，所述步骤1)中的反应混合物使用3至7体积的异丙醇处理。8.权利要求1的方法，其中，在步骤2)中，所述回收的生理活性多肽与所述非肽基聚合物反应0.5小时至4小时。9.权利要求1的方法，其中，所述生理活性多肽选自下组：胰岛素分泌肽、凝血因子、消化促进激素、胰岛素、胃泌酸调节素、胰高血糖素、肾上腺皮质激素、甲状腺激素、肠激素、细胞因子、酶、生长因子、神经肽、垂体激素、下丘脑激素、抗肥胖肽、抗病毒肽和具有生理活性的非天然肽衍生物。10.权利要求1的方法，其中，所述生理活性多肽选自下组：促红细胞生成素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胰淀素、生长抑素、肽YY(PYY)、神经肽Y(NPY)、血管紧缩素、缓激肽、降钙素、促肾上腺皮质激素、章鱼素(eledoisin)、胃泌素、瘦素、催产素、加压素、黄体化激素、促黄体激素、促卵泡激素、甲状旁腺激素、分泌素、舍莫瑞林、人生长激素(hGH)、生长激素释放肽、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、干扰素(IFN)、白细胞介素、催乳素释放肽、阿立新(orexin)、甲状腺释放肽、胆囊收缩素、胃泌素抑制肽、钙调蛋白、胃泌素释放肽、胃动素、血管活性肠肽、心房钠尿肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)、C型利钠肽(CNP)、神经激肽A、神经介肽、肾素、内皮缩血管肽、角蝰毒素肽、酪啡肽、皮啡肽、强啡肽、内啡肽、脑啡肽、T细胞因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体、尿激酶受体、肿瘤抑制剂、胶原酶抑制剂、胸腺生成素、胸腺肽、...

【专利技术属性】
技术研发人员：文瑄真，申清星，洪性熙，金大振，权世昌，
申请(专利权)人：韩美药品株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国,KR