转谷氨酰胺酶底物的鉴别及其用途制造技术

根据一个方面，本公开内容提供了一种使用包含多种肽的肽阵列鉴别转谷氨酰胺酶的底物的方法。所述方法包括以下步骤：使所述肽阵列中的肽与所述转谷氨酰胺酶接触，使所述转谷氨酰胺酶结合所述肽，和鉴别所述转谷氨酰胺酶的底物。

Identification of transglutaminase substrates and their uses

In accordance with one aspect, the present disclosure provides a method for identifying substrates of transglutaminase using a peptide array comprising a plurality of peptides. The method comprises the following steps of contacting the peptide in the peptide array with the transglutaminase, enabling the transglutaminase to bind the peptide, and identifying the substrate of the transglutaminase.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转谷氨酰胺酶底物的鉴别及其用途
技术介绍
本专利技术一般地涉及包含转谷氨酰胺酶底物的肽阵列和使用肽阵列鉴别转谷氨酰胺酶底物的方法。本专利技术也涉及转谷氨酰胺酶底物肽以及它们用于交联肽和蛋白的方法。阐明酶活性和特异性的细节对于理解酶的生理功能而言和对于由酶催化的反应的生物技术应用而言是重要的。例如，转谷氨酰胺酶属于有关酶的大家族，包括微生物和哺乳动物转谷氨酰胺酶。转谷氨酰胺酶通过形成谷氨酰胺残基的γ-甲酰胺基和赖氨酸残基的ε-氨基之间的异肽键来催化两个多肽或肽链之间的交联。阐明转谷氨酰胺酶活性和特异性的细节对于由转谷氨酰胺酶催化的交联反应的生物技术应用（例如，用于标记、加标签、多蛋白复合物形成等的蛋白的修饰）而言是重要的。因为它的小尺寸、稳健的性能、稳定性和它的活性的钙独立性，迄今为止微生物转谷氨酰胺酶是研究得最多的转谷氨酰胺酶。几个研究已经证实，多种长烷基胺可以替换转谷氨酰胺酶的赖氨酸底物，并且简单的二肽谷氨酰胺-甘氨酸(QG)可以充当谷氨酰胺底物。转谷氨酰胺酶的赖氨酸和谷氨酰胺底物的这些发现有助于开发关于转谷氨酰胺酶活性的多种测试和关于使用转谷氨酰胺酶修饰蛋白的实用测定。一个挑战是，作为酶底物的合成肽的鉴别受限于潜在大量的可以测试的分子。该障碍可以通过使用肽文库和选择技术（诸如噬菌体展示或mRNA展示）来克服。通过使用这些方案，已经鉴别出优选的底物序列。但是，序列的宽多样性使得难以发现共同底物基序，例如转谷氨酰胺酶底物基序。因此，需要快速的、廉价的和系统的方法，其可以实现具有许多重要应用的转谷氨酰胺酶底物和共同底物基序的鉴别。专利技术概述本专利技术通过提供用于鉴别转谷氨酰胺酶底物的系统和方法以及它们的用途克服了前述缺点。申请人已经发现了快速的、可靠的和系统的方案来鉴别被酶特异性地识别的底物序列和共同底物基序。在一个示例性的方面，在肽阵列上合成了至少100万种5-聚体转谷氨酰胺酶底物肽的文库，例如，使用无掩模的光指导的肽阵列技术。然后针对鉴别优选的酶底物或底物基序的酶活性来筛选所述肽阵列。在另一个实施方案中，在肽阵列上合成了至少100万种5-聚体转谷氨酰胺酶底物肽的文库，例如，使用无掩模的光指导的肽阵列技术。然后针对鉴别优选的酶底物的酶活性来筛选所述肽阵列。然后在新阵列上合成第二个新设计的聚焦的肽文库，其含有在第一步中鉴别出的序列的延长和突变变体，以选择在鉴别的基序周围的肽空间中具有最佳酶特异性的肽。肽阵列的高密度允许筛选大量肽，从而提供转谷氨酰胺酶底物的综合的和可再现的初步筛选。此外，由于在几天中建立新阵列的技术（例如，使用无掩模的光指导的肽合成），快速地搜索在最初鉴别的底物命中附近的肽空间的能力是可能的。根据本专利技术的一个实施方案，使用包括多种肽的肽阵列鉴别转谷氨酰胺酶的底物的方法包括以下步骤：使所述肽阵列中的肽与所述转谷氨酰胺酶接触，使所述转谷氨酰胺酶结合所述肽，和鉴别所述转谷氨酰胺酶的底物。在一个方面，所述肽阵列包含固体支持物。在另一个方面，通过无掩模的光指导的肽阵列合成使所述肽附着于所述固体支持物。在另一个方面，所述肽阵列具有至少1.2x106种附着于所述固体支持物的肽。在另一个方面，所述肽阵列具有至少1.4x106种附着于所述固体支持物的肽。在另一个方面，所述肽阵列具有至少1.6x106种附着于所述固体支持物的肽。在另一个方面，所述肽阵列具有至少1.8x106种附着于所述固体支持物的肽。在另一个方面，所述转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶。在另一个方面，所述微生物转谷氨酰胺酶是链轮丝菌属种（Streptoverticilliumsp.）转谷氨酰胺酶。在另一个方面，所述转谷氨酰胺酶是哺乳动物转谷氨酰胺酶。在另一个方面，所述哺乳动物转谷氨酰胺酶选自人因子XIIIA转谷氨酰胺酶、人因子XIIIB转谷氨酰胺酶、因子XIII转谷氨酰胺酶、角质形成细胞转谷氨酰胺酶、组织-型转谷氨酰胺酶、表皮转谷氨酰胺酶、前列腺转谷氨酰胺酶、神经元转谷氨酰胺酶、人转谷氨酰胺酶5和人转谷氨酰胺酶7。在另一个方面，所述转谷氨酰胺酶底物是谷氨酰胺底物肽。在另一个方面，所述转谷氨酰胺酶底物是赖氨酸底物肽。在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽包括选自以下的序列：DYALQ(SEQIDNO:1)、DYVLQ(SEQIDNO:2)、NYALQ(SEQIDNO:3)、EYALQ(SEQIDNO:4)、PYALQ(SEQIDNO:5)、EYVLQ(SEQIDNO:6)、DFALQ(SEQIDNO:7)、DYFLQ(SEQIDNO:8)、NYFLQ(SEQIDNO:9)、FYALQ(SEQIDNO:10)、DYTLQ(SEQIDNO:11)、NYVLQ(SEQIDNO:12)、EYVAQ(SEQIDNO:13)、RYALQ(SEQIDNO:14)、YFALQ(SEQIDNO:15)、PYVLQ(SEQIDNO:16)、WYALQ(SEQIDNO:17)、SYALQ(SEQIDNO:18)、HYALQ(SEQIDNO:19)、DYVAQ(SEQIDNO:20)、EFVAQ(SEQIDNO:21)、DFYLQ(SEQIDNO:22)、EFALQ(SEQIDNO:23)、EYFLQ(SEQIDNO:24)和NFVLQ(SEQIDNO:25)或它们的组合。在另一个方面，所述赖氨酸底物肽包括选自以下的序列：ARSKL(SEQIDNO:54)、KSKLA(SEQIDNO:55)、TKSKL(SEQIDNO:56)、KLSKL(SEQIDNO:57)、RSKLG(SEQIDNO:58)、RGSKL(SEQIDNO:59)、RGTKL(SEQIDNO:60)、FPKLK(SEQIDNO:61)、RSKSK(SEQIDNO:62)、SKSKL(SEQIDNO:63)、FTKSK(SEQIDNO:64)、KLKYK(SEQIDNO:65)、PKTKL(SEQIDNO:66)、RLKSK(SEQIDNO:67)、RSKLA(SEQIDNO:68)、GRSKL(SEQIDNO:69)、RAKYK(SEQIDNO:70)、SKLSK(SEQIDNO:71)、KLGAK(SEQIDNO:72)、QRSKL(SEQIDNO:73)、KTKYK(SEQIDNO:74)、LSKLK(SEQIDNO:75)、NRTKL(SEQIDNO:76)、QRTKL(SEQIDNO:77)、GGGRSKLAGGG(SEQIDNO:82)、GGGARSKLGGGG(SEQIDNO:80)和GYKLK(SEQIDNO:78)或它们的组合。在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽具有在第五个位置的谷氨酰胺残基。在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽具有包括[YF][VA]LQG的序列基序。在另一个方面，所述谷氨酰胺底物肽具有包括DYALQ(SEQIDNO:1)的序列。在另一个方面，所述赖氨酸底物肽具有包括SK[LS]K或[KR][ST]KL的序列基序。根据本专利技术的另一个实施方案，使用一个或多个包括多种肽的肽阵列鉴别转谷氨酰胺酶的底物的方法包括以下步骤：使第一个肽阵列中的肽与所述转谷氨酰胺酶接触，使所述转谷氨酰胺酶结合所述第一个肽阵列中的肽，选择在结合所述转谷氨酰胺酶后表现出预定特性的所述第一个肽阵列中的一种或多种肽，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于交联蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：将至少一种异源转谷氨酰胺酶底物肽序列掺入所述蛋白中；和通过使所述蛋白与转谷氨酰胺酶接触来交联所述蛋白，其中所述异源转谷氨酰胺酶肽序列包含序列基序[YF][VA]LQG和优选GDYALQGPG (SEQ ID NO: 79)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.19 US 62/0944951.一种用于交联蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：将至少一种异源转谷氨酰胺酶底物肽序列掺入所述蛋白中；和通过使所述蛋白与转谷氨酰胺酶接触来交联所述蛋白，其中所述异源转谷氨酰胺酶肽序列包含序列基序[YF][VA]LQG和优选GDYALQGPG(SEQIDNO:79)。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法另外包括将转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽掺入所述蛋白中的步骤。3.一种用于交联至少两种化合物的方法，所述方法包括下述步骤：将包含序列基序[YF][VA]LQG和优选GDYALQGPG(SEQIDNO:79)的异源转谷氨酰胺酶谷氨酰胺底物肽掺入所述至少两种化合物之一中；和通过使所述化合物与转谷氨酰胺酶接触来交联所述化合物。4.根据权利要求3所述的方法，所述方法另外包括将异源转谷氨酰胺酶赖氨酸底物肽掺入所述至少两种化合物中的另一种中的步骤。5.根据权利要求2或4所述的方法，其中所述赖氨酸底物肽包含SK[LS]K或[KR][ST]KL的序列基序。6.根据权利要求3-5中的任一项所述的方法其中所述化合物选自蛋白、肽和有机分子或它们的组合。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：T艾伯特，F贝格曼，V拉米切夫，J帕特尔，M施雷姆尔，W施特芬，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH