本发明专利技术公开了干扰素‑POEGMA结合体及其应用，所述高分子通过连接到所述蛋白质的引发剂而结合到所述蛋白质上。所述引发剂可连接到所述蛋白质的N‑或C‑端以及其它远离蛋白质活性位点和/或不影响蛋白质活性的任何位置。实验证明，以本发明专利技术所制备的IFN‑POEGMA结合体，产率高，纯化简单，位点特异性修饰，能够较好地保留了体外生物活性，提高了干扰素热稳定性，极大地改善了药物代谢动力学和生物分布，并且有效增强治疗功效。
Method for preparing interferon macromolecule binding body IFN-POEGMA
The invention discloses POEGMA interferon combination and application of the polymer by connecting to the initiator and protein binding to the protein. The initiator can be connected to the N or C end of the protein and other proteins from the active site and / or any position does not affect protein activity. Experiments show that the prepared IFN POEGMA combination, high yield, easy purification, site-specific modification, can better retain the biological activity in vitro, improves the thermal stability of interferon, and greatly improve the pharmacokinetic and biodistribution, and effectively enhance the therapeutic efficacy.
【技术实现步骤摘要】
一种制备干扰素高分子结合体IFN-POEGMA的方法
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种制备干扰素高分子结合体IFN-POEGMA的方法。
技术介绍
蛋白质已经广泛应用于生物医药显影、靶向治疗以及临床诊断等多个领域。单独使用蛋白质存在半衰期短、稳定性差等问题。将蛋白质与高分子相连制备蛋白质-高分子结合体，可以有效的提高蛋白质的溶解性、稳定性、药代动力学和治疗功效并降低其免疫原性。传统的蛋白质-高分子结合体的合成方法是将预先制备好的高分子与蛋白质相连，往往存在着偶联位点不确定、效率低、产率差、产物难以分离、质量控制差、活性难以保持等诸多难题。干扰素-α2(IFN-α2)是病毒复制和肿瘤细胞生长的强效抑制剂，已被成功用于治疗病毒性肝炎和癌症等疾病。但是，IFN经系统注射给药后循环半衰期非常短，需要频繁给药且在高浓度下才能达到预期的疗效，从而导致一些毒副作用，同时给患者带来沉重的经济负担。用聚乙二醇(PEG)修饰IFN，是改善其药代动力学和提高其疗效的有效措施，被称为长效干扰素。然而，目前的PEG化干扰素存在如反应产率低、结合位点和偶联化学计量难以控制、生物活性严重降低等弊端。因此，研发反应条件温和、步骤简单、高效的位点特异性修饰方法对干扰素及其他药用蛋白质尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种制备蛋白-高分子聚合物结合体的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：将蛋白-引发剂结合体、聚合物单体、CuCl、CuCl2、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺在缓冲液中进行聚合反应，得到蛋白-高分子聚合物结合体；所述蛋白-引发剂结合体为引发剂和蛋白共价连接得到的产物。上述蛋白-引发剂结合体为大分子引发剂。上述缓冲液为pH值为7.4、浓度为10mM的PBS水溶液，具体配方为：2.684gNa2HPO4·12H2O、0.34gNaH2PO4·2H2O、8.19gNaCl溶解于1L水中得到的溶液。上述方法中，所述反应体系包括：所述蛋白-引发剂结合体、所述聚合物单体、所述CuCl、所述CuCl2和所述1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的摩尔比为1：200-10000：10-500：10-2000：10-4000；所述蛋白-引发剂结合体、所述聚合物单体、所述CuCl、所述CuCl2和所述1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的摩尔比具体为1：1000-4000：25：75：125；所述蛋白-引发剂结合体中所述蛋白和所述引发剂的偶联比为1：1。在本专利技术的实施例中，上述蛋白-引发剂结合体为引发剂在蛋白的C端，二者通过形成酰胺键而形成结合体，具体按照包括如下步骤的方法制备：将IFN-LPETGGH6蛋白、SortaseA-H6蛋白、2-(2-(2-(2-氨基乙酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙基2-溴-2-甲基丙酸酯、CaCl2在pH7.4浓度为50mMTris·HCl水溶液中混合，反应，得到干扰素-引发剂结合体IFN-Br；上述IFN-LPETGGH6蛋白、SortaseA-H6蛋白、上述2制备的2-(2-(2-(2-氨基乙酰胺基)乙酰胺基)乙酰胺基)乙基2-溴-2-甲基丙酸酯、CaCl2的摩尔比为2：1：50：200。上述方法中，所述聚合反应在低氧或者惰性气体氛围下进行；所述聚合反应的时间是5分钟至24小时，所述聚合反应的温度是0-80℃。上述方法中，所述引发剂连接到所述蛋白的C-端。上述方法中，所述蛋白为干扰素，所述干扰素选自干扰素α或其融合蛋白、干扰素β或其融合蛋白、干扰素γ或其融合蛋白、干扰素λ或其融合蛋白。上述方法中，所述干扰素α融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。上述方法中，所述引发剂为寡聚甘氨酸功能化的原子转移自由基聚合(ATRP)引发剂；所述寡聚甘氨酸功能化的原子转移自由基聚合(ATRP)引发剂具体为2-(2-(2-(3,4-二溴代马来酰亚胺-N-乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基2-溴代-2-甲基丙酸酯。上述方法中，所述聚合物单体为水溶性或生物可降解的聚合物单体；所述高分子具体为POEGMA。由上述方法制备的蛋白-高分子聚合物结合体也是本专利技术保护的范围。上述的蛋白-高分子聚合物结合体在制备抗肿瘤产品中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术通过利用生物化学和高分子化学技术,在远离干扰素的C-末端进行修饰并通过优化过的原子转移自由基聚合(ATRP)技术原位高效生长出POEGMA(聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)，产生位点特异和单修饰的干扰素-高分子结合体(即IFN-POEGMA)。这种原位ATRP技术反应条件温和、产率高、纯化步骤简单、成本低，能够有效保持生物活性并提高体外稳定性，为蛋白质修饰提供一种通用的方法。附图说明图1为干扰素-高分子结合体合成路线的示意图。图2为通过镍柱亲和层析获得IFN-LPETGGH6。图3为原位ATRP引发剂AEBM的合成及纯化过程。图4为显示了原位ATRP引发剂通过转肽酶A催化连接到IFN的C-末端示意图。图5为IFN-Br合成及纯化过程分析。图6为MALDI-TOF分析IFN-LPETGGH6和IFN-Br的分子量。图7为LC-MS/ESI分析了IFN-Br的特异性修饰情况。图8为IFN-POEGMA合成及纯化过程。图9为SDS-PAGE和GPC分析IFN-POEGMA图10为显示了通过1HNMR分析IFN-POEGMA结合体。图11为分析原位ATRP合成IFN-POEGMA的对照试验。图12为通过“graftingto”技术获得IFN-POEGMA图13为SDS-PAGE分析蛋白酶K处理IFN-POEGMA。图14为通过原位ATRP得到不同分子量的IFN-POEGMA。图15为DLS分析IFN-POEGMA和IFN-Br的水合半径。图16为CD分析IFN-POEGMA和IFN-Br的二级结构。图17为MTT法测定IFN-POEGMA、派罗欣和IFN-Br的体外生物活性。图18为IFN-POEGMA、派罗欣和IFN-Br的体外热稳定性。图19为利用DAS软件中房室消除二房模型分析IFN-POEGMA、派罗欣和IFN-Br的药物代谢动力学情况。图20为IFN-POEGMA、派罗欣和IFN-Br在肿瘤和其他组织中的分布情况。图21为IFN-POEGMA、派罗欣、IFN-Br和生理盐水抑制肿瘤生长情况。图22为裸鼠注射IFN-POEGMA、派罗欣、IFN-Br和生理盐水后的生存曲线。图23为裸鼠注射IFN-POEGMA、派罗欣、IFN-Br和生理盐水后的体重变化情况。图24为裸鼠治疗结束后肿瘤、心脏、肝脏和肾脏HE染色情况。图25为裸鼠注射IFN-POEGMA、派罗欣、IFN-Br和生理盐水后乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮等生理指标变化情况。图26为裸鼠IFN-POEGMA、派罗欣、IFN-Br和生理盐水后红细胞、白细胞、血红蛋白和血小板等生理指标变化情况。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的质粒pET-25b(+)为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。下述实施例中的TB培养基按照如下方法配置：向900mL水中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备蛋白‑高分子聚合物结合体的方法，包括如下步骤：将蛋白‑引发剂结合体、聚合物单体、CuCl、CuCl
【技术特征摘要】
1.一种制备蛋白-高分子聚合物结合体的方法，包括如下步骤：将蛋白-引发剂结合体、聚合物单体、CuCl、CuCl2、1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺在缓冲液中进行聚合反应，得到蛋白-高分子聚合物结合体；所述蛋白-引发剂结合体为引发剂和蛋白共价连接得到的产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛋白-引发剂结合体、所述聚合物单体、所述CuCl、所述CuCl2和所述1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的摩尔比为1：200-10000：10-500：10-2000：10-4000；所述蛋白-引发剂结合体中所述蛋白和所述引发剂的偶联比为1：1。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述蛋白-引发剂结合体、所述聚合物单体、所述CuCl、所述CuCl2和所述1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺的摩尔比为1：1000...
【专利技术属性】
技术研发人员：高卫平，胡瑾，王贵林，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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