一种基于大豆低聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于大豆低聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法及应用，属于生物、食品加工技术领域。通过糖基化接枝手段将大豆低聚糖糖链引入到不同来源的抗冻多肽中，合成抗冻糖肽。本发明专利技术抗冻糖肽具有良好的抗冻功能，可用于细胞、组织、器官、微生物及冷冻食品的低温冷冻保存。添加本发明专利技术抗冻糖肽的细胞、组织、器官、微生物的冷冻存活率均显著提高；将本发明专利技术应用到冷冻保藏食品中，可以很好地保持冷冻食品原有品质的稳定性，显著降低冷冻损伤引起的食品品质劣变。

Preparation method and application of antifreeze glycopeptide based on soybean oligosaccharide modification

The invention discloses a preparation method and application of antifreeze glycopeptide based on soybean oligosaccharide modification, belonging to the field of biological and food processing technology. The soybean oligosaccharide chains were introduced into antifreeze peptides from different sources by the method of glycosylation graft to prepare antifreeze glycopeptides. The antifreeze glycopeptide has good anti freezing function, and can be used for cryopreservation of cells, tissues, organs, microorganisms and frozen foods. Microbial cells, tissues and organs, with the invention of the antifreeze glycopeptide freeze survival rate was significantly increased; the invention is applied to the frozen food, can maintain a good stability of the original quality of frozen food, frozen food quality significantly reduce the damage caused by variable.

【技术实现步骤摘要】
一种基于大豆低聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法及应用
本专利技术具体涉及一种基于大豆低聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法及应用，属于生物、食品加工

技术介绍
抗冻蛋白，俗称冰结构蛋白，又叫作热滞蛋白，首先于1969年由Devries在南极海峡的一种极地鱼（Trematomusborchgrevinki）的血液中发现。抗冻蛋白具有低温保护活性，可以作为冷冻保护剂应用于医学、生物及食品加工等领。如抗冻蛋白应用于组织、细胞及微生物的低温保存，可以显著提高其冷冻存活率；抗冻蛋白能减少冷冻食品在低温冻藏过程形成的冰晶及其重结晶对食品造成的品质劣变，提高冷冻食品的稳定性。抗冻蛋白的抗冻活性主要来源于抗冻蛋白中的某些活性片段，并不是整个蛋白在起作用。汪少芸等人通过酶解技术从牛皮、猪皮及鱼皮等不同来源的胶原蛋白中酶解、分离出具有高抗冻活性的多肽片段。近年来有研究发现重结晶抑制活性对于抗冻蛋白发挥冷冻保护作用起到了至关重要的作用，然而抗冻蛋白的热滞活性和冰结合特性对于当冻藏温度低于热滞活性温度区间的生物材料（如细胞、血液、组织）反而起到破坏甚至致死作用，主要因为当冻藏温度低于热滞活性温度范围时，冰晶生长不受控制而快速转变成针状结构，进而导致细胞损伤和解冻后细胞存活率的下降。这也是阻碍天然抗冻蛋白（或肽）作为冷冻保护剂进行实际应用的主要因素。因此，近年来国际研究开始致力于开发一些具有重结晶抑制活性而没有热滞活性的新型抗冻蛋白，基于糖基化修饰的抗冻蛋白就是这类活性物质的一种。例如一个由4个Ser-Gly-Gly三肽重复的肽链为骨架并通过Ser残基的碳端连接一个半乳糖苷基形成的抗冻肽就发现具有很强的重结晶抑制活性而没有热滞活性。此外，研究还发现糖基种类和肽链骨架中糖基化位置及氨基酸残基类型对重结晶抑制活性有着显著的影响作用，如半乳糖基修饰的抗冻肽重结晶抑制活性比甘露糖基修饰的抗冻肽强，而脯氨酸由于具有限制的旋转角可使蛋白在溶液中具有明显二级结构，因此一些含脯氨酸的具有较强的重结晶抑制活性。大豆低聚糖是一种低甜度、低热量的甜味剂，其甜度为蔗糖的70%，其热量是每克8.36千焦耳，仅是蔗糖热能的1/2，而且安全无毒。大豆低聚糖主要分布在大豆胚轴中，其主要成分为水苏糖、棉子糖。大豆低聚糖的保温、吸湿性比蔗糖小，但优于果葡糖浆。大豆低聚糖具有通便洁肠、促进肠道内双歧杆菌增殖、降低血清胆固醇、保护肝脏、抑制肠内腐败物质的生成的作用。适用于中老年便秘患者、生活不规律的人、运动缺乏的人等。因此，本专利技术将不同来源的抗冻多肽与大豆低聚糖通过糖基化修饰手段，化学合成抗冻糖肽。所合成的抗冻糖肽的抗冻活性显著高于原始抗冻多肽，可以广泛应用于细胞、组织、器官、微生物及冷冻食品的低温冷冻保存；并且该方法安全、易于控制，可以大规模工业化生产。
技术实现思路
本专利技术目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于大豆低聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法及应用。添加本专利技术抗冻糖肽的细胞、组织、器官、微生物的冷冻存活率均显著提高；将本专利技术应用到冷冻保藏食品中，可以很好地保持冷冻食品原有品质的稳定性，显著降低冷冻损伤引起的食品品质劣变。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种基于大豆低聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法，按照如下方法制备：将抗冻多肽和大豆低聚糖按照质量比为1:1~1:5的比例溶解于磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，溶液最终浓度为5~15%（w/v），搅拌使其充分溶解；然后在60~80℃、pH为8.0~9.0条件下反应1~2h；反应结束后，立即放在0℃的水中冷却以终止反应，反应后的溶液冷冻干燥，得到所述的大豆低聚糖修饰的抗冻糖肽冻干粉。所述的抗冻多肽粉的原料来源于猪皮、牛皮、鱼皮或鱼鳞。所述的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH为7.6~8.0，其中NaH2PO4为0.2M，Na2HPO4为0.2M。所述的搅拌时间为10~20min；所述的冷却时间为15~30min。如上所述的制备方法制得的抗冻糖肽的用途，所述的抗冻糖肽制备用于细胞、组织、器官、微生物及冷冻食品的低温冷冻保存。本专利技术所提供的技术方案具有如下优势：（1）本专利技术所用的抗冻多肽原料来源于食品源下脚料，具有安全无毒、来源广泛，价格便宜等优势；（2）本专利技术提供的抗冻糖肽合成方法高效、安全、成本低，易于控制；（3）本专利技术合成的抗冻糖肽应用广泛，可应用于细胞、组织、器官、微生物及冷冻食品的低温冷冻保存；并且与抗冻多肽相比，其抗冻活性显著提高；（4）本专利技术中的大豆低聚糖是一种具有特殊功能营养和特定功能的食品，大豆低聚糖具有通便洁肠、促进肠道内双歧杆菌增殖、降低血清胆固醇、保护肝脏、抑制肠内腐败物质的生成的作用。具体实施措施以下结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不仅仅限于这些实施例。实施例1一种基于大豆低聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法，按照如下方法进行：（1）按照抗冻多肽粉（来源于猪皮）和大豆低聚糖之间质量比为1:2.7的比例将抗冻多肽粉和大豆低聚糖混合，然后溶解于pH7.6的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2MNaH2PO4，0.2MNa2HPO4）中，溶液最终浓度为10%（w/v），搅拌15min使其充分溶解；（2）溶解后的抗冻多肽与大豆低聚糖混合液在77℃、pH为8.74条件下反应67min；反应结束后，立即放在冰水中冷却20min，终止反应，反应后的溶液冷冻干燥，得到抗冻糖肽冻干粉。实施例2（1）按照抗冻多肽粉（来源于牛皮）和大豆低聚糖之间质量比为1:1的比例将抗冻多肽粉和大豆低聚糖混合，然后溶解于pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2MNaH2PO4，0.2MNa2HPO4）中，溶液最终浓度为5%（w/v），搅拌10min使其充分溶解；（2）溶解后的抗冻多肽与大豆低聚糖混合液在60℃、pH为8.0条件下反应67min；反应结束后，立即放在冰水中冷却15min，终止反应，反应后的溶液冷冻干燥，得到抗冻糖肽冻干粉。实施例3（1）按照抗冻多肽粉（来源于鱼皮）和大豆低聚糖之间质量比为1:5的比例将抗冻多肽粉和大豆低聚糖混合，然后溶解于pH8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（0.2MNaH2PO4，0.2MNa2HPO4）中，溶液最终浓度为15%（w/v），搅拌20min使其充分溶解；（2）溶解后的抗冻多肽与大豆低聚糖混合液在80℃、pH为9.0条件下反应67min；反应结束后，立即放在冰水中冷却30min，终止反应，反应后的溶液冷冻干燥，得到抗冻糖肽冻干粉。应用例1本专利技术抗冻糖肽在微生物冷冻保存中的应用按照如下方法进行：试验处理：A.空白对照（去离子水），B.大豆低聚糖，C.未进行糖基化修饰的抗冻多肽，D.实施例1制备的抗冻糖肽。试验方法：（1）制备种子液：取保存的嗜热链球菌在M17液体培养基中复苏，37℃，180r/min培养一夜，OD值约为1.3。（2）准备实验菌液：取50μL的种子液在盛有4mLM17液体培养基的试管中培养4h，此时菌液的OD约为1.2。（3）将实验菌液用灭菌去离子水稀释100倍，取100μL的稀释菌液转移到2mL的塑料冷冻管中，与900μL的抗冻保护剂混合，涡旋混合器混匀。（4）取样品混合液50μL在4mL的M17液体培养基中培养7h，检测600nm处的OD值。取完本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于大豆低聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法，其特征在于：按照如下方法制备：将抗冻多肽和大豆低聚糖按照质量比为1:1 ~ 1:5的比例溶解于磷酸氢二钠‑磷酸二氢钠缓冲液中，溶液最终浓度为5 ~ 15%（w/v），搅拌使其充分溶解；然后在60 ~ 80 ℃、pH为8.0 ~ 9.0条件下反应1 ~ 2 h；反应结束后，立即放在0 ℃的水中冷却以终止反应，反应后的溶液冷冻干燥，得到所述的大豆低聚糖修饰的抗冻糖肽冻干粉。

【技术特征摘要】
1.一种基于大豆低聚糖修饰的抗冻糖肽的制备方法，其特征在于：按照如下方法制备：将抗冻多肽和大豆低聚糖按照质量比为1:1~1:5的比例溶解于磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，溶液最终浓度为5~15%（w/v），搅拌使其充分溶解；然后在60~80℃、pH为8.0~9.0条件下反应1~2h；反应结束后，立即放在0℃的水中冷却以终止反应，反应后的溶液冷冻干燥，得到所述的大豆低聚糖修饰的抗冻糖肽冻干粉。2.根据权利要求1所述的抗冻糖肽的制备方法，其特征在于：所述的抗冻多肽粉的...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪少芸，陈惠敏，王文龙，陈旭，蔡茜茜，方卫东，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35