一种有活性的天然蛋白质无载体运输方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种有活性的天然蛋白质无载体运输方法，先利用生物模拟转氨反应对天然蛋白质进行修饰，即，天然蛋白质N末端在磷酸吡哆醛的作用下转化为醛，进而和羟胺通过形成肟而被荧光小分子修饰；修饰后的天然蛋白质自主运输进入细胞，实现多种药用天然蛋白质的无载体运输。本发明专利技术提供的无载体运输方法对不同天然蛋白及细胞系具有普适性，可用于多种天然蛋白和蛋白酶的无载体运输，这些外源性天然蛋白不仅可以提高胞内相关蛋白含量，达到治疗某些蛋白缺陷类治病的目的；还可以提高胞内某些酶的活力水平，调控活性氧物种相对含量，进而调控相关活性氧信号通路，在神经退行性疾病和癌症的研究和诊疗中具有重要意义和广阔的应用前景。

An active natural protein free carrier method and Application

The invention discloses an active natural protein non carrier transport method, which first modifies natural protein by biological simulated ammonia conversion reaction, that is, the N end of natural protein is converted into aldehyde under the action of pyridoxal phosphate, and then hydroxylamine is modified by small fluorescein molecules by forming oxime; the modified natural protein is modified. Mass autonomous transportation enters cells, enabling free transportation of many kinds of medicinal natural proteins. The non carrier transport method provided by this invention is universally suitable for different natural proteins and cell lines, and can be used for the non carrier transport of a variety of natural proteins and proteases. These exogenous natural proteins can not only improve the content of intracellular proteins, but also achieve the purpose of treatment of some protein defects. The activity of some enzymes, the regulation of the relative content of reactive oxygen species, and the regulation of the related reactive oxygen species signal pathway, is of great significance and wide application in the research and diagnosis and treatment of neurodegenerative diseases and cancer.

【技术实现步骤摘要】
一种有活性的天然蛋白质无载体运输方法及应用
本专利技术涉及蛋白质的运输方法，具体地指一种有活性的天然蛋白质无载体运输方法及应用。
技术介绍
随着全球经济的快速发展、生活环境和健康观念的变化、慢性疾病发病率的年年攀升以及人口老龄化等因素影响，与人类生活质量密切相关的生物医药行业近年来一直保持了持续高速增长的趋势。根据全球知名的市场调研公司PMR发布的报告，全球生物药品市场将在2020年达到2871.4亿美元。随着医药研发的进步，市场上基于蛋白质的治疗药物的数量呈指数级增长。美国是生物工程产业的龙头，目前已批准近150个蛋白质药物上市，日本和欧洲是生物技术的重要发源地，目前已有几十种蛋白质药物批准上市，还有百余种蛋白质药物在临床试验当中。相比于国外，国内的蛋白质药物起步晚，研发相对滞后，但经过近几十年的发展，产业规模不断扩大，被列为国家“十二五”规划重点发展的领域之一。较传统药物而言，蛋白质类药物具有高活性、高特异性、低毒性以及生物功能明确等优势，与此同时，大分子蛋白质类药物存在若干缺陷使其应用受到一定的限制，诸如生物安全性和利用率较低，半衰期短、生物活性不稳定，局限于静脉、皮下和肌肉注射等侵入式给药方式以及生产、贮运成本高等。因为大多数蛋白不能自发地进入动物细胞，使其在细胞实验、临床研究及应用方面临诸多困难。因此，发展安全，稳定和有效的蛋白质运输及释放系统变得至关重要。通过化学转染，电穿孔，病毒或非病毒基因载体等方法将重组DNA或mRNA递送至胞内进而表达出相应蛋白是一种行之有效外源蛋白运输手段手段，但是却面临长效未知的安全风险，蛋白质的直接运输成为另外一种选择。早在1982年，Okada等人就报道了一种高渗作用介导的蛋白质运输方法，但是转染效率极低并且具有较大的细胞毒性。2000年Green和Frankel等人证明HIVTAT肽可以自主跨膜，后来进一步实验表明，将TAT和重组蛋白融合可以将目标蛋白运输至胞内，并且适用于几乎所有的细胞，从此细胞穿透肽(cellpenetratingpeptide，CPP)受到广泛研究并应用于生物大分子的运输过程，但是CPP介导的蛋白运输依赖于目标蛋白的理化性质，并且会影响目标蛋白的功能及亚细胞定位。此外，抗体(Songetal,2015)，受体配体(Rizketal,2009)，纳米微粒(Hasadsrietal,2009)及病毒样微粒(Voelkeletal,2010)也常常作为一种蛋白质运输手段，但是这些方法普适性较差并且需要高的蛋白剂量。近几年，DavidRLiu研究团队详细研究了超电荷蛋白(Superchargedproteins，SCPs)的性质，功能及其应用，经改造的蛋白结构和功能不受影响，并且具有较高的转染效率，同时可作为其他生物大分子的运输载体。2015年，NielsGeijsen等人发展了一个名为“iTOP”蛋白运输系统，其中NaCl高渗作用介导的大胞饮，与其组合转染化合物(丙烷甜菜碱)共同促进蛋白质的胞吞作用。载体依赖型的蛋白质运输体系中载体的制备以及与目标蛋白的融合或连接均是相对复杂繁琐的过程，于此同时，超电荷蛋白的获得步骤复杂，需要突变和表达，“iTOP”系统利用NaCl介导的高渗作用会破坏细胞膜，导致细胞死亡。因此，发展一种简单易行的普适性蛋白质无载体运输体系尤为重要。而且，非载体依赖的天然蛋白质运输体系尚未见报导。
技术实现思路
本专利技术为了能够实时跟踪活细胞中蛋白质运输过程，研究蛋白质的功能、定位及拓展其应用，利用生物模拟转氨反应对天然蛋白质进行了基于荧光小分子的N末端特异性荧光标记，提供一种有活性的天然蛋白质无载体运输方法及应用。为实现上述目的，本专利技术所设计的有活性的天然蛋白质无载体运输体系，其特别之处在于：先利用生物模拟转氨反应对天然蛋白质进行修饰，即，天然蛋白质N末端在磷酸吡哆醛的作用下转化为醛，进而和羟胺通过形成肟而被荧光小分子修饰；修饰后的天然蛋白质自主运输进入细胞，实现多种药用天然蛋白质的无载体运输。本专利技术中，所述对天然蛋白质进行修饰的具体步骤如下：1)称取天然蛋白质溶于磷酸盐缓冲溶液中，形成蛋白质溶液，按天然蛋白质与磷酸吡哆醛的摩尔比1:200称取磷酸吡哆醛溶于同等体积的磷酸盐缓冲溶液，并与所述蛋白质溶液混合，室温搅拌反应18h；2)将反应后的混合溶液离心浓缩，通过分离纯化除去未反应完的磷酸吡哆醛，得到磷酸吡哆醛修饰后的蛋白质，命名为Protein-PLP；3)取标定蛋白浓度后的Protein-PLP，溶于磷酸盐缓冲溶液中，再按Protein-PLP与化合物4(Ⅰ)的摩尔比1:50加入化合物4(Ⅰ)，室温下搅拌反应18h；4)将反应后的混合溶液离心浓缩，通过分离纯化除去未反应完的化合物4(Ⅰ)，得到荧光标记修饰后的蛋白质，命名为Protein-RhB(Ⅱ)；反应式如下：本专利技术中，所述化合物4(Ⅰ)的制备方法包括以下步骤：1)N-羟基氨基甲酸叔丁脂溶于乙腈中，缓慢加入1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，补加乙腈；再加入1,6-二溴己烷，补加乙腈；在室温下反应3h后向反应器中补加1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，室温反应2h，升温至50℃，搅拌回流；反应结束后减压浓缩，接着溶解于乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂中，硅藻土过滤，再浓缩得到粗产品并通过柱色谱分离纯化，得到化合物1；2)哌嗪溶解于四氢呋喃中，加热搅拌回流；将步骤1)得到的化合物1溶解于四氢呋喃中，缓慢加入反应器，回流搅拌过夜；抽滤除去固体，滤液旋干，用无水乙醚和饱和氯化钠溶液分层，水层用无水乙醚萃取三次，合并有机层用无水MgSO4干燥，浓缩得到化合物2；3)将罗丹明B与苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯溶解于二氯甲烷中，加入N，N-二异丙基乙胺；室温搅拌后，加入步骤2)得到的化合物2；薄层色谱检测反应进程，待反应完成，加入去离子水，接着用二氯甲烷萃取5次，合并有机层，浓缩得到粗产品并通过柱色谱分离纯化，得到化合物3；4)将步骤3)得到的化合物3溶解于三氟乙酸：二氯甲烷混合溶剂中，室温反应0.5h后，旋转蒸发除去溶剂，重复以上步骤，通过薄层色谱法监测反应进程，直至反应完全，最后得到化合物4(Ⅰ)。本专利技术还提供了上述有活性的天然蛋白质无载体运输方法在调控胞内相关活性氧(ROS)物种水平方面和相关药物研发中的应用。其中，所述活性氧(ROS)主要为O2·-及H2O2。本专利技术还提供了上述有活性的天然蛋白质无载体运输方法在神经退行性疾病和癌症治疗方面的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术利用生物模拟转氨反应对天然蛋白质进行了基于荧光小分子的N末端特异性荧光标记修饰。修饰后的天然蛋白质在没有外源载体的协助下可自主快速地进入细胞，并能够保持活性，发挥正常的生理功能。在此基础上，本专利技术成功标记多种具有不同分子量、不同结构的天然蛋白，并且成功运输至多种细胞胞内，表明了这种标记修饰方法的普适性以及无载体运输方法的广普性，并且该方法简单易行，可实现多种天然药用蛋白的无载体运输，这为天然蛋白的运输提供了新的方向。本专利技术提供的有活性的天然蛋白质无载体运输方法在某些神经退行性疾病(如肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默症)以及癌症的研究和诊疗中具有重要意义和广阔的应用前景本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种有活性的天然蛋白质无载体运输方法，其特征在于：先利用生物模拟转氨反应对天然蛋白质进行修饰，即，天然蛋白质N末端在磷酸吡哆醛的作用下转化为醛，进而和羟胺通过形成肟而被荧光小分子修饰；修饰后的天然蛋白质自主运输进入细胞，实现多种药用天然蛋白质的无载体运输。

【技术特征摘要】
1.一种有活性的天然蛋白质无载体运输方法，其特征在于：先利用生物模拟转氨反应对天然蛋白质进行修饰，即，天然蛋白质N末端在磷酸吡哆醛的作用下转化为醛，进而和羟胺通过形成肟而被荧光小分子修饰；修饰后的天然蛋白质自主运输进入细胞，实现多种药用天然蛋白质的无载体运输。2.根据权利要求1所述的有活性的天然蛋白质无载体运输方法，其特征在于：所述对天然蛋白质进行修饰的具体步骤如下：1)称取天然蛋白质溶于磷酸盐缓冲溶液中，形成蛋白质溶液，按天然蛋白质与磷酸吡哆醛的摩尔比1：200称取磷酸吡哆醛溶于同等体积的磷酸盐缓冲溶液，并与所述蛋白质溶液混合，室温搅拌反应18h；2)将反应后的混合溶液离心浓缩，通过分离纯化除去未反应完的磷酸吡哆醛，得到磷酸吡哆醛修饰后的蛋白质，命名为Protein-PLP；3)取标定蛋白浓度后的Protein-PLP，溶于磷酸盐缓冲溶液中，再按Protein-PLP与化合物4(Ⅰ)的摩尔比1:50加入化合物4(Ⅰ)，室温下搅拌反应18h；4)将反应后的混合溶液离心浓缩，通过分离纯化除去未反应完的化合物4(Ⅰ)，得到荧光标记修饰后的蛋白质，命名为Protein-RhB(Ⅱ)；反应式如下：3.根据权利要求2所述的有活性的天然蛋白质无载体运输方法，其特征在于：所述化合物4(Ⅰ)的制备方法包括以下步骤：1)N-羟基氨基甲酸叔丁脂溶于乙腈中，缓慢加入1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，补加乙腈；再加入1,6-二溴己烷，补加...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长林，石家愿，赵丹，刘春荣，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42