一种鉴别蛤蚧及其产品的PCR特异性引物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学与中药鉴定领域，具体公开了一种鉴别蛤蚧及其产品的PCR特异性引物及其应用。本发明专利技术基于蛤蚧的COI序列，筛选出适合蛤蚧鉴别的短片段，并设计特异性引物，本发明专利技术的2组特异性引物COISF2/COISR2和COISF3/COISR3扩增效率高，特异性强，并相互验证，通过凝胶电泳检测，可适用于蛤蚧基原动物、蛤蚧中药材、蛤蚧类产品的鉴定。尤其是特异性引物COISF3/COISR3，通过扩增到较短片段(133bp)，可实现含蛤蚧的中成药的鉴定，简单快捷，不需要测序，成本低，适合大量样本的检测，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别蛤蚧及其产品的PCR特异性引物及其应用
本专利技术涉及分子生物学与中药(材)鉴定领域，具体地说，涉及一种鉴别蛤蚧及其产品的PCR特异性引物。
技术介绍
中药蛤蚧为壁虎科动物蛤蚧(大壁虎)(GekkogeckoLinnaeus)的干燥全体，为我国名贵动物中药材，为历届药典所收载，具有补肺益肾、纳气定喘、助阳益精的功效，可用于肺肾不足、虚喘气促、劳嗽咳血、阳痿、遗精等症。蛤蚧酒、人参蛤蚧散等保健品，蛤蚧定喘丸、蛤蚧定喘胶囊、参蛤平喘胶囊等药品应用广泛，但国内蛤蚧早已供不应求，野生蛤蚧于1989年便被列为“国家二级保护动物”，现市场蛤蚧主要依靠进口。因其疗效显著，市场需求逐年增长，且国内资源不足，市场已有混伪品出现。朱华等收集了各类商品蛤蚧，18个样品中竟只有2个为正品，或因形态相似，如喜山鬣蜥、变色树蜥；或因名字相同，如小蛤蚧(壁虎)、藏蛤蚧(喜山鬣蜥)，以上情况直接影响临床用药安全。目前，蛤蚧的鉴定方法主要有形态鉴定、显微鉴定、化学鉴定，但形态鉴定要求样品有一定的完整性，显微鉴定和化学鉴定则非针对专属组织或专属成分，难以实现蛤蚧的准确鉴定。近年来，DNA条形码技术在中药鉴定领域发展迅速，可以实现蛤蚧的精准鉴定，但因其基于DNA测序技术，大量样品检测，成本高，而且，采用通用引物扩增的COI序列长度约为750bp，炮制品或存放时间久的样品因DNA降解则不易扩增。因此，筛选到适合蛤蚧鉴别的短片段更有应用价值。DNAmini-barcoding和特异性PCR鉴定技术应运而生，但至今未筛选到与COI基因相媲美的高效mini-barcoding及其引物。虽然现有技术中存在对蛤蚧进行特异性PCR鉴定的研究报道，但均未涉及含蛤蚧的中成药的鉴定。因此，亟需开发一种可鉴定含蛤蚧中成药的试剂和方法。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种鉴别蛤蚧及其产品的PCR特异性引物及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术首先提供一种鉴别蛤蚧及其产品的PCR特异性引物，为以下引物(1)和/或引物(2)所示的特异性引物：引物(1)：COISF2：5’-GCCTCCGCGAGTGTG-3’；COISR2：5’-CGTGTATTGGGTTATGCTTGG-3’；引物(2)：COISF3：5’-AAAATGAAAACCCCAAG-3’；COISR3：5’-TACGAACGGTCAACAA-3’。上述引物(1)和引物(2)可分别独立使用。进一步地，含有所述特异性引物的试剂或试剂盒也属于本专利技术的保护范围。第二方面，本专利技术提供所述特异性引物在鉴别蛤蚧及其产品中的应用。所述应用具体可体现为一种蛤蚧及其产品的鉴别方法，所述方法包括如下步骤：S1、提取待检样品的DNA；S2、以S1提取的DNA为模板，使用本专利技术所述特异性引物进行PCR扩增；S3、对S2所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过产物条带判断待检样品中是否含有蛤蚧。具体为：若使用引物(1)所示的特异性引物扩增出200bp的单一DNA条带，则样品中含有蛤蚧，若无该条带，则样品中不含蛤蚧；若使用引物(2)所示的特异性引物扩增出133bp的单一DNA条带，则样品中含有蛤蚧；若无该条带，则样品中不含蛤蚧。其中，本专利技术所述鉴别方法中的所述待检样品可为蛤蚧基原动物、蛤蚧中药材或含蛤蚧产品，在其中，所述含蛤蚧产品具体可为含蛤蚧的保健品或中成药等。进一步地，本专利技术提供一个具体的进行PCR扩增反应的反应体系，为25μL：2×TaqPCRMix12.5μL，正向引物1μL(2.5μM)，反向引物1μL(2.5μM)，DNA模板1μL，加ddH2O补充至25μL。进一步地，本专利技术针对不同的引物分别优化了不同的PCR反应条件，具体表现为：当使用引物(1)进行PCR扩增反应时，优选PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，61℃30s，72℃30s，40次循环；72℃10min。当使用引物(2)进行PCR扩增反应时，优选PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，49℃30s，72℃30s，40次循环；72℃5min。本专利技术经过实验研究发现，本专利技术所提供的引物(2)相比引物(1)，可检测更多种类的含蛤蚧的保健品或中成药。因此，本专利技术在保护引物(1)和引物(2)的前提下，进一步优选使用引物(2)作为鉴别含蛤蚧的产品的特异性引物。本专利技术涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本专利技术的有益效果在于：本专利技术基于蛤蚧的COI序列，筛选出适合蛤蚧鉴别的短片段，并设计特异性引物，本专利技术的2组特异性引物COISF2/COISR2和COISF3/COISR3扩增效率高，特异性强，并相互验证，通过凝胶电泳检测，可适用于蛤蚧基原动物、蛤蚧中药材、蛤蚧类产品的鉴定。尤其是特异性引物COISF3/COISR3，通过扩增到较短片段(133bp)，可实现含蛤蚧的中成药的鉴定，简单快捷，不需要测序，成本低，适合大量样本的检测，具有广阔的应用前景。附图说明图1为蛤蚧及其混伪品CO1序列扩增电泳图。其中，M：Marker，从上至下为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-3：蛤蚧；4：无蹼壁虎；5：疣尾蜥虎；6：丽棘蜥；7：蚌西拟树蜥；8：变色树蜥；9：喜山岩蜥；10：拉萨岩蜥；11：叶城沙蜥；12：大耳沙蜥；13：西藏沙蜥；14：石龙子；15：山溪鲵；16：东方蝾螈；17：中国瘰螈；18：红瘰疣螈；CK：阴性对照。图2为蛤蚧及其混伪品特异性引物COISF2/COISR2扩增电泳图。其中，M：Marker，从上至下为500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，100bp，50bp；1-18：同图1；CK：阴性对照。图3为蛤蚧及其混伪品特异性引物COISF3/COISR3扩增电泳图。其中，M：Marker，从上至下为500bp，400bp，300bp，200bp，150bp，100bp，50bp；1-18：同图1；CK：阴性对照。图4为蛤蚧特异性引物灵敏度检测图。其中，图4a为COI序列扩增对照图；1-3：100ng/μL；4-6：10ng/μL；7-9：1ng/μL；10-12：100pg/μL；13-15：10pg/μL；16-18：1pg/μL；CK：阴性对照；图4b为特异性引物COISF2/COISR2灵敏度检测图；1-18：同图4a；CK：阴性对照；图4c为特异性引物COISF3/COISR3灵敏度检测图；1-18：同图4a；CK：阴性对照。图5为含蛤蚧的保健品及中成药检测图。其中，图5a为保健品及中成药COI序列扩增电泳图；1-3：人参蛤蚧散；4-6：参蛤平喘胶囊；7-9：蛤蚧党参膏；10-12：蛤蚧定喘胶囊；13-15：蛤蚧定喘丸；CK：阴性对照；图5b为保健品及中成药特异性引物COISF2/COISR2扩增电泳图；1-15：同图5a；CK：阴性对照；图5c为保健品及中成药特异性引物COISF3/COISR3扩增电泳图；1-15：同图5a；CK：阴性对照。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别蛤蚧及其产品的PCR特异性引物，其特征在于，为以下引物(1)和/或引物(2)所示的特异性引物：引物(1)：COISF2：5’‑GCCTCCGCGAGTGTG‑3’；COISR2：5’‑CGTGTATTGGGTTATGCTTGG‑3’；引物(2)：COISF3：5’‑AAAATGAAAACCCCAAG‑3’；COISR3：5’‑TACGAACGGTCAACAA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别蛤蚧及其产品的PCR特异性引物，其特征在于，为以下引物(1)和/或引物(2)所示的特异性引物：引物(1)：COISF2：5’-GCCTCCGCGAGTGTG-3’；COISR2：5’-CGTGTATTGGGTTATGCTTGG-3’；引物(2)：COISF3：5’-AAAATGAAAACCCCAAG-3’；COISR3：5’-TACGAACGGTCAACAA-3’。2.含有权利要求1所述特异性引物的试剂。3.含有权利要求1所述特异性引物的试剂盒。4.权利要求1所述的特异性引物在鉴别蛤蚧及其产品中的应用。5.一种蛤蚧及其产品的鉴别方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、提取待检样品的DNA；S2、以S1提取的DNA为模板，使用权利要求1所述特异性引物进行PCR扩增；S3、对S2所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若使用引物(1)所示的特异性引物扩增出200bp的单一DNA条带，则样品中含有蛤蚧，若无该条带，则样品中不含蛤蚧；若使用...

【专利技术属性】
技术研发人员：向丽，苏燕燕，陈士林，张栋，李西文，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11