一种环境化学品对大鼠甲状腺系统影响的测定方法技术方案

本发明专利技术公开了一种环境化学品对大鼠甲状腺系统影响的评估方法。该方法通过化学品对大鼠的暴露，利用酶联免疫吸附试验实现对血浆甲状腺激素水平的快速分析，并利用特异性、高灵敏的荧光实时定量PCR方法实现对甲状腺相关基因表达水平的相对定量分析。通过分析血浆甲状腺激素水平的变化以及与甲状腺激素合成、转运、代谢和功能发挥密切相关的基因表达水平的变化，基于分子生物学构建了一种环境化学品甲状腺干扰效应评估的方法。该方法能够系统的分析环境化学品对大鼠甲状腺系统的影响，具有获得信息全面、重复性好、特异性强等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种环境化学品对大鼠甲状腺系统影响的测定方法
本专利技术属于化学品毒性评价领域，涉及一种基于分子生物学的评估方法，通过环境化学品对甲状腺信号通路的改变来评估小剂量环境化学品的甲状腺干扰效应。
技术介绍
甲状腺激素对于动物生长发育、代谢调控具有重要作用。研究发现，一些外源化合物能够对生物体甲状腺系统产生影响，干扰体内甲状腺激素稳态，这类外源化学物质被称为甲状腺干扰物。目前，已发现百余种甲状腺干扰物，包括高氯酸盐、多氯联苯、多环芳烃、多溴联苯醚、双酚A类及多种有机磷、有机氯和氨基甲酸酯类农药等。随着经济的快速发展，每天都有大量的新型化学品(如工业化学品、农药、药物及个人护理用化学品、阻燃剂等)被开发出来，这些化学品已成为影响人体与生态健康的重要风险源。因此，在其流入市场之前，评估这些化学品对哺乳动物甲状腺系统的潜在影响，从而实现有效的风险防控具有深远的意义。甲状腺干扰物对生物体甲状腺系统影响的途径较多，例如干扰甲状腺激素的合成与转运，干扰甲状腺激素在外周组织中的代谢转化，干扰甲状腺激素的降解清除以及干扰甲状腺激素与受体结合等。目前，虽然有多种技术手段可以对甲状腺干扰效应进行评估，如非洲爪蟾尾吸收实验、甲状腺运载蛋白竞争结合实验、模拟计算等，但由于甲状腺干扰物毒性作用方式的复杂性，尚未有技术方法能够系统、全面的评估外源化合物对哺乳动物甲状腺系统的影响。本专利技术基于分子生物学构建了一种环境化学品对哺乳动物大鼠甲状腺系统影响的评估方法。该方法不仅分析了环境化学品对甲状腺激素含量的影响，还从甲状腺激素合成、转运、代谢、降解清除及功能发挥等方面构建了哺乳动物甲状腺信号通路。通过分析环境化学品对甲状腺激素水平及甲状腺信号通路的影响情况，全面直观的分析外源化合物的甲状腺干扰效应，是一种理想的评价手段，具有系统、全面的特点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种评估环境化学品对大鼠甲状腺系统干扰的方法。利用酶联免疫吸附试验对大鼠血浆甲状腺激素水平进行快速分析，利用高度特异性的荧光实时定量PCR方法对甲状腺激素合成、转运、代谢、作用发挥及降解清除等相关基因表达水平进行有效分析，基于分子生物学构建了甲状腺激素信号通路，用于评估环境化学品暴露对大鼠甲状腺系统的影响。该方法具有获得信息全面、重复性好、特异性强等优点，能直观的分析环境化学品对大鼠甲状腺系统的影响。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：基于分子生物学实验方法，以大鼠为实验材料，通过暴露测试物(环境化学品)，分析大鼠血浆甲状腺激素含量的变化以及与甲状腺激素合成、转运、代谢、功能发挥、降解清除有关的基因表达水平的变化，构建环境化学品甲状腺干扰效应的毒性作用通路，评估其对大鼠甲状腺系统的影响。具体包括以下步骤：以雄性SpragueDawley品系大鼠为材料，首先进行化学品暴露实验，步骤如下：控制体重为180～240g，6～10周龄，平分为4组；暴露实验进行之前在屏障系统内进行适应检查，给药期间动物单笼饲育，饲育方式为每日经口灌胃一次，连续7～28天；给药期间，动物自由摄食饮水；动物解剖前禁食过夜，不限制饮水；采用戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉，腹部大动脉取全血样移入5mL离心管中储存，并使用肝素钠抗凝；采血结束后对动物进行系统解剖，取出动物的甲状腺、肝脏等脏器，并剥去任何粘附的组织，-80℃低温保存。随后，对获得的血样进行离心处理，4000rpm离心10～15min；利用酶联免疫吸附试验方法对其中的甲状腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、游离甲状腺素(FT4)及游离三碘甲腺原氨酸(FT3)含量进行定量分析。计算各组数据平均值，将试验组与对照组的数据平均值进行T检验比较。若P值小于0.05且试验组数据平均值大于对照组数据平均值，说明该每天暴露量的环境化学品暴露升高了甲状腺激素水平，引起甲亢；若P值小于0.05且试验组数据平均值小于对照组数据平均值，说明该每天暴露量的环境化学品暴露降低了甲状腺激素水平，引起甲减；若不满足上述条件，说明该每天暴露量的环境化学品暴露未对甲状腺激素水平产生影响。最后，对组织样本甲状腺激素相关基因表达水平的定量分析分3步完成。第一步为总RNA的提取与质量鉴定。在研钵中倒入液氮进行冷却，尚有液氮时将冰箱中取出的冷冻组织转移至研钵中，继续添加液氮并将冷冻组织研磨成粉末(甲状腺与肝脏组织分别研磨)；将粉末倒入塑料离心管中，分别取100mg甲状腺和肝脏，分别进行如下操作：按100mg组织/1mL加入总RNA提取试剂；快速振荡15～30s，室温放置20～30min，使其充分裂解；4℃，12,000rpm离心10～15min，弃沉淀；按200μl氯仿/1mL总RNA提取试剂加入氯仿，剧烈振荡15～30s，室温放置3～5min；4℃，12,000rpm离心15～20min；取无色水相至另一离心管中，尽量不要混入中间白色的变性蛋白质；按1mL异丙醇/1mL总RNA提取试剂加入异丙醇，室温放置20～30min；4℃，12,000rpm离心15～20min，RNA沉降在管底，弃上清；按1mL75％乙醇/1mL总RNA提取试剂加入体积浓度75％的乙醇，轻弹管底，悬浮沉淀；4℃，7,500rpm离心10～15min，弃上清；将塑料离心管倒扣在滤纸上，室温干燥15～30min；用30μL无RNA酶水溶解RNA样品；利用微量紫外-可见光分光光度计对RNA浓度进行定量分析。第二步为总RNA反转录为cDNA。首先进行基因组DNA消化：分别稀释RNA样品浓度至0.5μg/mL；配制5μL反应体系：总RNA2.0μL、10×buffer0.5μL、DNaseI(1U/μL)1.0μL、无核酸酶水1.5μL；反应程序为：37℃保温30min；加入0.5μL0.2mMEDTA；65℃10min终止反应。然后进行RNA反转录：将上述1μg总RNA(5.5μL)置于一支0.2mL离心管中，70℃水浴10min，离心5秒；配置20μL反应体系：MgCl2(质量浓度15mM)2.0μL、AMVRT10×RTbuffer2.0μL、dNTPs2.0μL、RNasin0.5μL、Oligo(dT)151.0μL、AMV反转录酶(22U/μL)0.68μL、RNA样品5.5μL、无核酸酶水6.32μL；反应程序为：42℃，60min，95℃5min，4℃5min。第三步为设计基因特异性引物。本专利技术涉及甲状腺系统的多个组成部分，包括甲状腺激素合成、甲状腺激素转运、甲状腺激素代谢、甲状腺激素作用发挥及甲状腺激素降解清除。为保证检测方法的特异性与高灵敏性，根据Genbank数据库分别设计各个基因PCR扩增引物，具体如下(基因名斜体加粗表示，F表示正向引物，R表示反向引物)：甲状腺激素合成相关基因：①Tshr,F:GCAAGGAACTCCACCGAATC,R:GCAGGCTCGAAAAGGCAAG；②Slc5a5,F:GGCCTTACCAGCACCTACCA,R:ACAGGAGCGATGCCCAGAT；③Tg,F:AGAGGGGATGGAGGTGTATGG,R:CTGGGGTGGCGATTTGTCT；④Tpo,F:CACCACAGAGCACCAGCACA,R:AGGAGCGGTAGAAAGGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环境化学品对大鼠甲状腺系统影响的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：(a)试验组：环境化学品经口每天暴露大鼠7‑28天后，收集血液及甲状腺、肝脏样品；以未经环境化学品暴露大鼠血液及甲状腺、肝脏样品为对照组；(b)对步骤(a)所得到血液样品进行预处理，利用酶联免疫吸附实验对血液样品中的甲状腺激素进行定量分析，计算各组数据平均值；将试验组与对照组的数据平均值进行T检验比较，若P值小于0.05且试验组数据平均值大于对照组数据平均值，说明该每天暴露量的环境化学品暴露升高了甲状腺激素水平，引起甲亢；若P值小于0.05且试验组数据平均值小于对照组数据平均值，说明该每天暴露量的环境化学品暴露降低了甲状腺激素水平，引起甲减；若不满足上述条件，说明该每天暴露量的环境化学品暴露未对甲状腺激素水平产生影响；(c)对步骤(a)所得到的甲状腺、肝脏样品分别进行预处理，利用荧光实时定量PCR实验对甲状腺、肝脏样品中的甲状腺激素相关基因表达水平分别进行定量分析，计算各组数据平均值，将试验组与对照组的数据平均值进行T检验比较，并计算试验组数据平均值÷对照组数据平均值；若P<0.05且试验组数据平均值÷对照组数据平均值>2表明该暴露量的环境化学品显著升高了该基因表达水平；若P<0.05且试验组数据平均值÷对照组数据平均值<0.5表明该暴露量的环境化学品显著降低了该基因表达水平；若不满足上述条件，则表明该暴露量的环境化学品未对该基因表达水平产生影响。...

【技术特征摘要】
1.一种环境化学品对大鼠甲状腺系统影响的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：(a)试验组：环境化学品经口每天暴露大鼠7-28天后，收集血液及甲状腺、肝脏样品；以未经环境化学品暴露大鼠血液及甲状腺、肝脏样品为对照组；(b)对步骤(a)所得到血液样品进行预处理，利用酶联免疫吸附实验对血液样品中的甲状腺激素进行定量分析，计算各组数据平均值；将试验组与对照组的数据平均值进行T检验比较，若P值小于0.05且试验组数据平均值大于对照组数据平均值，说明该每天暴露量的环境化学品暴露升高了甲状腺激素水平，引起甲亢；若P值小于0.05且试验组数据平均值小于对照组数据平均值，说明该每天暴露量的环境化学品暴露降低了甲状腺激素水平，引起甲减；若不满足上述条件，说明该每天暴露量的环境化学品暴露未对甲状腺激素水平产生影响；(c)对步骤(a)所得到的甲状腺、肝脏样品分别进行预处理，利用荧光实时定量PCR实验对甲状腺、肝脏样品中的甲状腺激素相关基因表达水平分别进行定量分析，计算各组数据平均值，将试验组与对照组的数据平均值进行T检验比较，并计算试验组数据平均值÷对照组数据平均值；若P&lt;0.05且试验组数据平均值÷对照组数据平均值&gt;2表明该暴露量的环境化学品显著升高了该基因表达水平；若P&lt;0.05且试验组数据平均值÷对照组数据平均值&lt;0.5表明该暴露量的环境化学品显著降低了该基因表达水平；若不满足上述条件，则表明该暴露量的环境化学品未对该基因表达水平产生影响。2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤a中，实验材料为雄性SpragueDawley品系大鼠(Rattusnorvegicus)，控制体重为180～240g，6～10周龄，平分为4组；暴露实验进行之前在屏障系统内进行适应检查，给药期间动物单笼饲育，饲育方式为每日经口灌胃一次，连续7～28天；给药期间，动物自由摄食饮水；动物解剖前禁食过夜，不限制饮水；采用戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉，腹部大动脉取全血样移入5mL离心管中储存，并使用肝素钠抗凝；采血结束后对动物进行系统解剖，取出动物的甲状腺、肝脏等脏器，并剥去任何粘附的组织，-80℃低温保存。3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤b中，对步骤a中获得的血样进行离心处理，4000rpm离心10～15min；利用酶联免疫吸附试验方法对其中的甲状腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、游离甲状腺素(FT4)及游离三碘甲腺原氨酸(FT3)含量进行定量分析；计算各组数据平均值，将试验组与对照组的数据平均值进行T检验比较；若P值小于0.05且试验组数据平均值大于对照组数据平均值，说明该每天暴露量的环境化学品暴露升高了甲状腺激素水平，引起甲亢；若P值小于0.05且试验组数据平均值小于对照组数据平均值，说明该每天暴露量的环境化学品暴露降低了甲状腺激素水平，引起甲减；若不满足上述条件，说明该每天暴露量的环境化学品暴露未对甲状腺激素水平产生影响。4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤c中，对步骤a获得的组织样本甲状腺激素相关基因表达水平的定量分析分3步完成；第一步为总RNA的提取与质量鉴定，在研钵中倒入液氮进行冷却，尚有液氮时将冰箱中取出的冷冻组织转移至研钵中，继续添加液氮并将冷冻组织研磨成粉末(甲状腺与肝脏组织分别研磨)；将粉末倒入塑料离心管中，分别取100mg甲状腺和肝脏，分别进行如下操作：按100mg组织/1mL加入总RNA提取试剂；快速振荡15～30s，室温放置20～30min，使其充分裂解；4℃，12,000rpm离心10～15min，弃沉淀；按200μl氯仿/1mL总RNA提取试剂加入氯仿，剧烈振荡15～30s，室温放置3～5min；4℃，12,000rpm离心15～20min；取无色水相至另一离心管中，尽量不要混入中间白色的变性蛋白质；按1mL异丙醇/1mL总RNA提取试剂加入异丙醇，室温放置20～30min；4℃，12,000rpm离心15～20min，RNA沉降在管底，弃上清；按1mL75％乙醇/1mL总RNA提取试剂加入体积浓度75％的乙醇，轻弹管底，悬浮沉淀；4℃，7,500rpm离心10～15min，弃上清；将塑料离心管倒扣在滤纸上，室温干燥15～30min；用30μL无RNA酶水溶解RNA样品；利用微量紫外-可见光分光光度计对RNA浓度进行定量分析；第二步为总RNA反转录为cDNA，首先进行基因组DNA消化：分别稀释RNA样品浓度至0.5μg/mL；配制5μL反应体系：总RNA2.0μL、10×buffer0.5μL、DNaseI(1U/μL)1.0μL、无核酸酶水1.5μL；反应程序为：37℃保温30min；加入0.5μL0.2mMEDTA；65℃10min终止反应；然后进行RNA反转录：将上述1μg总RNA(5.5μL)置于一支0.2mL离心管中，70℃水浴10min，离心5秒；配置20μL反应体系：MgCl2(质量浓度15mM)2.0μL、AMVRT10×RTbuffer2.0μL、dNTPs2.0μL、RNasin0.5μL、Oligo(dT)151.0μL、AMV反转录酶(22U/μL)0.68μL、RNA样品5.5μL、无核酸酶水6.32μL；反应程序为：42℃，60min，95℃5min，4℃5min；第三步为设计基因特异性引物；...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫玉峰，张海军，耿柠波，陈吉平，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21