黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性的检测方法。本发明专利技术采用PCR产物直接测序法对KISS1基因多态性位点进行检测，以探寻KISS1基因多态性和表达量与产羔数之间的相关性，为进一步研究黔北麻羊繁殖性状的遗传机制提供依据。首次在黔北麻羊KISS1基因第1内含子处检测到3个SNP，分别为G277C，G436T，T486A，其中G277C，T486A位点的三个基因型个体之间的产羔数达到差异显著。由此可知，KISS1基因内含子1位点的变异影响黔北麻羊的产羔数。

Detection method of single nucleotide polymorphisms of KISS1 gene in North Guizhou Ma sheep

The present invention provides a method for detecting single nucleotide polymorphisms of KISS1 gene in North Guizhou Ma sheep. The invention adopts the PCR product direct sequencing method to detect KISS1 gene polymorphism, KISS1 gene polymorphism and to explore the correlation between the expression quantity and litter size, provide the basis for further study on genetic mechanism of Qianbei Ma goat reproductive traits. For the first time in the detection of Qianbei Ma goat KISS1 gene intron first to 3 SNP, respectively G277C, G436T, T486A, G277C, litter size between the three genotypes of T486A loci reached significant differences. Therefore, intron 1 of KISS1 gene mutations affecting Qianbei Ma goat litter size.

【技术实现步骤摘要】
黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性的检测方法
本专利技术涉及生物
，尤其是一种黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性的检测方法。
技术介绍
产羔数是山羊的重要经济性状之一，繁殖性能高低直接关系到山羊养殖业生产成本和生产效率。山羊产羔数低，是一个遗传力很低(0.1左右)的数量性状，如仅靠传统育种技术很难改良这一性状。因此，在一些多胎的山羊品系中筛选和发掘影响多胎性能的主效基因，并应用于多胎品系的选育，对提高山羊繁殖性能具有重要意义。Kisspeptin/GPR54途径被认为是青春期发育和生殖功能的关键途径。KISS1基因编码的产物Kisspeptins蛋白能与GPR54相结合，组成KISS1/gpr54系统，Kisspeptins蛋白已经成为下丘脑中产生促性腺激素释放激素(GnRH)的神经元的必需上游调节剂。到目前为止，已经有一些关于KISS1基因作为动物繁殖性状的候选基因的研究，这表明该基因在动物繁殖中起重要作用，但是关于KISS1基因对黔北麻羊繁殖性能的影响却未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是：提供一种黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性的检测方法，能准确的检测出黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性，为进一步研究黔北麻羊繁殖性状的遗传机制提供依据。本专利技术是这样实现的：黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性的检测方法，以引物对P对黔北麻羊KISS1基因的第1内含子进行PCR扩增；并通过直接测序技术对基因进行分型，进而得到黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性序列；所述的引物对引物对P的上游引物：5’-CTTGTGTTTGCTGGACAGTCT，引物对P的下游引物的序列为：5’-TGCTCCCTCCCAACCTTCTT。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。将得到黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性序列与产羔性状进行相关性分析；具体的是：采用最小二乘法拟合线性模型对个基因型和产羔数进行差异显著性检测，结果均以“最小二乘均值±标准误”表示；线性模型如式(1)：Yijk＝u+FTi+Gj+Eijk(1)如式(1)中，Yijk为个体表型，u为群体平均值，FTi为胎次效应，Gj为基因型效应，Eijk为随机误差。还包括对多态位点等位基因的基因频率、基因型频率、杂合度、纯合度、有效等位基因数和多态信息含量的检测。由于采用了以上技术方案，本专利技术采用PCR产物直接测序法对KISS1基因多态性位点进行检测，以探寻KISS1基因多态性与产羔数之间的相关性，为进一步研究黔北麻羊繁殖性状的遗传机制提供依据。首次在黔北麻羊KISS1基因第1内含子处检测到3个SNP，分别为G277C，G436T，T486A，其中G277C，T486A位点的三个基因型个体之间的产羔数达到差异显著。由此可知，KISS1基因内含子1位点的变异影响黔北麻羊的产羔数，因此在黔北麻羊育种中，可通过选择BB基因型作为提高产羔数的辅助选择依据。本专利技术方法简单，易于实施，使用效果好。附图说明图1为黔北麻羊全基因组DNA琼脂糖凝胶检测结果；图2为KISS1基因第1内含子部分片段扩增结果(最左边泳道为DL5000DNAMarker)；图3分别为黔北麻羊KISS1基因第1内含子G277C位点不同基因型测序峰图。图4分别为黔北麻羊KISS1基因第1内含子G436T位点不同基因型测序峰图。图5分别为黔北麻羊KISS1基因第1内含子T486A位点不同基因型测序峰图。具体实施方式本专利技术的实施例：黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性的检测方法1、基因组DNA提取分别采取136头具有产羔记录的经产黔北麻羊母羊血样，使用生工生物工程(上海)有限公司的血液基因组DNA抽提试剂盒从黔北麻羊血液中提取基因组DNA，具体步骤如下：(1)取50-100μL抗凝血液加入到1.5ml离心管中，在加入100μLPBSSolution使总体积为200μL。(2)加入20μLProteinaseK，混匀。在加入200μLBufferCL,震荡混匀，56℃水浴10min。(3)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀。(4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min,在10000rpm室温离心1min,倒掉收集管中的废液。(5)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μLCW1Solution,10000rpm离心30s倒掉废液。(6)将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μLCW2Solution,10000rpm离心30s倒掉废液。(7)将吸附柱放回收集管中，于12000rpm室温离心1min,离去残留的CW2Solution。(8)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50μLCEBuffer静置3min,12000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。部分基因组DNA电泳结果如图1所示，可知所提基因组DNA条带清晰，无拖尾现象，说明DNA完整性好且浓度高，可作为后续试验PCR的模板使用。2、引物设计与合成参照GenBank收录的绵羊KISS1全基因组序列(GenBank登录号：GU142847.1)，运用Primier5.0和Oligo软件对部分外显子10设计特异性引物，目的片段为242bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列为：上游引物：5’-CTTGTGTTTGCTGGACAGTCT-3’下游引物：5’-TGCTCCCTCCCAACCTTCTT-3’3、PCR扩增PCR反应体系为：2×TaqPCRMasterMix5μL,DNA模板1μL,上、下游引物各1μL，加水至10μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30min，33个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增结果如图2所示，扩增片段与目的片段大小一致，条带单一，可用于后续试验。4、克隆测序(1)对所有个体的PCR产物进行测序，按照上述PCR反应程序和体系进行扩增。取5μL扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳中检测。(2)将PCR产物目的条带的切割和称重，并按每100mg琼脂糖中加入300-600μL的溶胶液BufferB2，充分混匀；50℃水浴5～10min，直至胶完全熔化，将所得溶液转移至吸附柱中，8000×g室温离心30s，弃上清；将吸附柱中加入500μL漂洗液，9000×g室温离心30s，弃上清；重复上述步骤一次；将吸附柱于9000×g室温离心1min，除去残留的漂洗液，将吸附柱室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，向吸附柱中间滴加15-40μlddH2O，室温静置1-2min。9000×g室温离心1min洗脱DNA，收集管中溶液，将所得到的DNA溶液置于-20度保存或用于后续试验。(3)利用T-载体PCR产物克隆试剂盒进行山羊KISS1基因T载体重组质粒的构建，反应体系如下：胶回收的PCR产物3ul；pUCm-T载体1ul；10×LigationBuff本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：以引物对P对黔北麻羊KISS1基因的第1内含子进行PCR扩增；并通过直接测序技术对基因进行分型，进而得到黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性序列；所述的引物对引物对P的上游引物：5’‑CTTGTGTTTGCTGGACAGTCT，引物对P的下游引物的序列为：5’‑TGCTCCCTCCCAACCTTCTT。

【技术特征摘要】
1.一种黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：以引物对P对黔北麻羊KISS1基因的第1内含子进行PCR扩增；并通过直接测序技术对基因进行分型，进而得到黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性序列；所述的引物对引物对P的上游引物：5’-CTTGTGTTTGCTGGACAGTCT，引物对P的下游引物的序列为：5’-TGCTCCCTCCCAACCTTCTT。2.根据权利要求1所述的黔北麻羊KISS1基因单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于：所述的PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈祥，李鹏程，黄兰，龙威海，骆金红，王鑫，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52