锈色棕榈象甲特异性引物及快速分子检测方法技术

本发明专利技术提供了锈色棕榈象甲特异性引物及快速分子检测方法。本发明专利技术通过分析锈色棕榈象甲线粒体COI基因，设计了特异性引物对，所述特异性引物对核苷酸序列分别见序列表SEQ ID No.1‑2和SEQ ID No.3‑4所示。本发明专利技术的锈色棕榈象甲快速分子检测方法，是以样品总DNA为模板，利用上述两对引物的任一对进行PCR扩增，根据琼脂糖电泳判定结果。本发明专利技术引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为锈色棕榈象甲的鉴定提供了检测方法。

Detection method of rust colored palm weevil specific primers and rapid molecular

The present invention provides a method of detecting rust palm weevil specific primers and rapid molecular. The present invention through the analysis of rust colored palm weevil mitochondrial COI gene specific primers designed for the specific primers of nucleotide sequences were found sequence table SEQ 2 and SEQ No.1 ID ID No.3 4 shows. Detection method of rust colored palm weevil fast molecules of the invention, is to sample total DNA as template, either by using the two pairs of primers for amplification of PCR, according to the results of agarose gel electrophoresis. The invention of primers specific, rapid and simple detection method, high accuracy, good sensitivity, provides a detection method for identification of rust red palm weevil.

【技术实现步骤摘要】
锈色棕榈象甲特异性引物及快速分子检测方法
本专利技术涉及生物检测鉴定技术，具体地说涉及对锈色棕榈象甲进行PCR鉴定用引物及使用该引物对锈色棕榈象甲进行的PCR鉴定方法。
技术介绍
随着全球经济一体化的加快，林业外来生物入侵的形势日趋严峻。一些重大林业入侵物种已对我国的森林资源、物种多样性与生态安全造成了重大损失。锈色棕榈象甲Rhynchophorusferrugineus(Oliver)属鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae隐颏象亚科Rynchoporinae棕榈象属Rhynchophorus，又称红棕象甲、椰子隐喙象、椰子甲虫、亚洲棕榈象甲、印度锈色棕榈象甲，被列入我国进境植物检疫性有害生物名录和林业检疫性有害生物名录。锈色棕榈象甲主要在棕榈植物叶柄基部和生长点附近的干部危害，其危害主要发生在幼虫期。幼虫钻进树干内取食茎杆疏导组织，致使树干成空壳，树势渐衰弱，易受风折。由于幼虫在树干内危害，初期受害不易发现，一旦发现，受害植株多无法挽救，而油棕、椰子等棕榈植物成林时间较长，一旦死亡，损失较大。锈色棕榈象甲原产南亚和东南亚，1906年作为椰子Cocosnucifera的主要害虫在印度被报道，1920年在伊拉克发现，直到20世纪80年代中期锈色棕榈象甲作为海枣PhoenixSpp.的主要害虫在中东地区大面积暴发，此后逐渐由北非向欧洲蔓延，90年代末几乎使地中海沿岸国家和地区的油棕Elaeisguineensis全部死亡。现已广泛分布于全球，包括以色列、科威特、埃及、法国、葡萄牙、巴基斯坦、菲律宾、日本、澳大利亚、墨西哥等40多个国家和地区。我国于20世纪90年代在福建(厦门)首次发现锈色棕榈象甲，随后广东、广西(1997)、海南(2000)、云南(2000)、上海(2003)、浙江(2007)、重庆(2008)、贵州(2010)。目前，包括西藏(墨脱)在内我国已有13个省市自治区不同程度地受到锈色棕榈象甲的危害。主要危害树种有油棕、椰子、加拿利海枣Phoenixcanariensis、槟榔Arecacatechu、糖棕Borassusflabellifer、霸王棕Bismarckianobilis、等30余种棕榈科植物及甘蔗Saccharumsp.。锈色棕榈象甲对3-15年生棕榈植物危害较重，较少危害30-50年生的老树。成虫喜产卵于植株幼嫩组织伤口上，幼虫孵化后从树冠受害部位侵入树体，而不从树干的受伤部位侵入。锈色棕榈象甲早期危害很难被察觉，后期被害树与健康树有明显差异，受害树中心叶片干枯，叶子减少，倒披下来，当移开枯死的叶柄，能看到锈色棕榈象甲结的茧，剥开表皮可看到幼虫钻蛀的坑道。受害严重的植株，心叶枯萎，生长点死亡，只剩下数片老叶，此时植株难以挽救，有的树干甚至被蛀食中空，只剩下空壳。锈色棕榈象甲的危害，不仅给国民经济造成巨大损失，也破坏了自然景观及生态环境，成为绿色棕榈植物资源的一大“杀手”，对我国丰富的热带木本粮油树种资源及产业构成严重威胁。植物检疫，是防止外来有害生物入侵和扩散的最有效的手段。近年来，我国在棕榈科苗木调运中不断截获锈色棕榈象甲。为了将锈色棕榈象甲和国内常见象甲类昆虫区分开来，需要大量形态学鉴别工作，这些工作大多费时、费力且需要专业的昆虫分类学知识。并且，处于卵、幼虫、蛹这三个虫态的象甲类昆虫在形态上非常相似，只能在获取到成虫样本的时候才能进行，处于卵、幼虫、蛹这三个虫态的象甲类昆虫在形态上非常相似，目前还没有可靠的鉴定特征。近些年，越来越多的研究已证明分子生物学手段能够为鉴定害虫提供有力依据。线粒体DNA严格母性遗传，其中的细胞色素氧化酶I基因(COI)具有高度保守，结构稳定，无内含子的特点。因此，常作为昆虫DNA条形码用于物种分类、鉴定和亲缘关系的研究。目前尚无锈色棕榈象甲的分子快速鉴定技术。为了保护我国林业种质资源，需要建立一种能够对难以从形态上进行判断的锈色棕榈象甲进行辨别，且应该适合检验检疫部门检查应用，简单且精确的锈色棕榈象甲快速鉴定方法，以防止锈色棕榈象甲通过国内外苗木调运进入国境危害林业。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种锈色棕榈象甲的PCR鉴定用引物及PCR鉴定方法，对难以从形态上进行判断的锈色棕榈象甲进行简单且精确的鉴定。本专利技术以锈色棕榈象甲为靶标，与锈色棕榈象甲在国内常见的象甲种类作为参照，设计基于线粒体COⅠ基因序列的种特异性引物，并构建和优化了锈色棕榈象甲的快速分子检测体系。本专利技术首先提供了锈色棕榈象甲PCR鉴定用的特异性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-2，或SEQIDNO.3-4所示。本专利技术提供了上述特异性引物在苗木害虫检验检疫中的应用。本专利技术进一步提供了锈色棕榈象甲PCR鉴定用的特异性引物组合，该引物组合含有2对特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-2和SEQIDNO.3-4所示。本专利技术提供了上述特异性引物组合在苗木害虫检验检疫中的应用。本专利技术还提供了上述特异性引物或特异性引物组合在鉴定锈色棕榈象甲中的应用。具体地，本专利技术提供一种锈色棕榈象甲的快速分子检测方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳判定结果，当以SEQIDNO.1-2所示的引物进行PCR扩增时，若扩增产物为458bp，则待测样品来自锈色棕榈象甲；或当以SEQIDNO.3-4所示的引物进行PCR扩增时，若扩增产物为454bp，则待测样品来自锈色棕榈象甲。上述快速分子检测方法中，25μLPCR反应体系为：其中，PCR的反应条件为：预变性94℃、2min；再经94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。所述样品总DNA来自锈色棕榈象甲的去头和鞘翅的成虫，或幼虫的腹部组织。更进一步地，本专利技术提供了一种锈色棕榈象甲的快速分子检测方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述2对特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳判定结果，当以SEQIDNO.1-2所示的引物进行PCR扩增时，扩增产物为458bp，并且当以SEQIDNO.3-4所示的引物进行PCR扩增时，扩增产物为454bp，则待测样品来自锈色棕榈象甲。上述快速分子检测方法中，25μLPCR反应体系为：其中，PCR的反应条件为：预变性94℃、2min；再经94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。本专利技术提供了一种锈色棕榈象甲鉴定用试剂盒，含有SEQIDNO.1-2所示的特异性引物或含有SEQIDNO.3-4所示的特异性引物。本专利技术还提供了一种锈色棕榈象甲鉴定用试剂盒，含有SEQIDNO.1-2和SEQIDNO.3-4所示的特异性引物。本专利技术的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本专利技术的引物，根据需要该引物可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外，本专利技术的试剂盒中还可以包括用于PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本专利技术所需要的其它成分及用具。通过使用本专利技术的引物，对锈色棕榈象甲的DNA进行扩增，生成锈色棕榈象甲特异扩增片段，具有种特异性，从而能够特异且精确地对锈色棕榈象本文档来自技高网...

【技术保护点】
锈色棕榈象甲PCR鉴定用的特异性引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2，或SEQ ID NO.3‑4所示。

【技术特征摘要】
1.锈色棕榈象甲PCR鉴定用的特异性引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-2，或SEQIDNO.3-4所示。2.锈色棕榈象甲PCR鉴定用的特异性引物组合，其特征在于，含有2对特异性引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-2和SEQIDNO.3-4所示。3.权利要求1所述的特异性引物或权利要求2所述的特异性引物组合在苗木害虫检验检疫中的应用。4.权利要求1所述的特异性引物或权利要求2所述的特异性引物组合在鉴定锈色棕榈象甲中的应用。5.一种锈色棕榈象甲的快速分子检测方法，该方法以样品总DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳判定结果，当以SEQIDNO.1-2所示的引物进行PCR扩增时，若扩增产物为45...

【专利技术属性】
技术研发人员：宗世祥，陶静，骆有庆，任利利，阎伟，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11