本发明专利技术公开了一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物及方法。所述的鉴别引物包括CBYF和CBYR，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该方法包括以下步骤：提取待检测样本的基因组DNA作为PCR的模板；对待检测样本基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并进行电泳分离鉴定；于342bp处观察到条带，则该待测样本为黄腿螯蜂；否则，则该待测样本不是黄腿螯蜂。本发明专利技术可以简单快速有效的在分子生物学水平对黄腿螯蜂进行分子鉴定。
A differential primer and method for the molecular biology of the chelate wasp
The invention discloses a differential primer and method for the molecular biology of the Yellow legged chelate bee. The primers including CBYF and CBYR, respectively. The sequences such as SEQ ID and SEQ NO.1 ID shown in NO.2. The method comprises the following steps: to extract the genomic DNA samples of the PCR as a template; treat samples of genomic DNA was amplified by PCR, PCR and PCR products electrophoresis identification; 342bp bands were observed, then the sample for the Yellow legged dryinid; otherwise, the sample to be measured not yellow legs dryinid. The invention can be simple, rapid and effective at molecular biological level for molecular identification of cheloni.
【技术实现步骤摘要】
一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物及方法
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物及方法。
技术介绍
黄腿螯蜂(Pseudogonatopusflavifemur)属于膜翅目肿腿蜂总科(Bethyloidea)螯蜂科(Dryinidae)，雌雄异形的外寄生蜂。雌虫无翅，咀嚼式口器，不仅寄生寄主致死还主动捕获取食寄主致死，是十分具有生物防治潜力的天敌。稻田中还有其他3种常见的螯蜂，包括黑腹螯蜂(Haplogonatopusatratus)、稻虱红螯蜂(Haplogonatopusjaponicus)和双色螯蜂(Echthrodelphaxbicolor)。这4种螯蜂是水稻重要害虫稻飞虱(包括褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱)的寄生性天敌，由于螯蜂兼具寄生性和捕食性，对稻飞虱的发生具有较好的抑制作用，特别是黄腿螯蜂喜好寄生和取食近年频繁爆发为害的褐飞虱，对褐飞虱的为害具有十分良好的控制作用。但是由于螯蜂的雌雄虫在形态上十分相似，特别是雄虫形态上基本无法区分，且寄生飞虱后其幼虫形成的幼虫囊即使在显微镜下也能难区分。因此，目前只能通过专业的昆虫分类专家对其进行形态学上的区分。物种鉴定难的现状限制了对黄腿螯蜂的进一步研究和利用，如在调查田间稻飞虱被螯蜂寄生率时就很难明确黄腿螯蜂所占的比例，或是在田间采集到螯蜂茧未能羽化或羽化出雄蜂也非常难鉴定为何种螯蜂。为了解决这一难题，需要寻找一找分子生物学区分方法进行鉴别。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物及方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物，包括CBYF和CBYR，其序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。本专利技术还公开了一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别方法，包括以下步骤：步骤1、提取待检测样本的基因组DNA作为PCR的模板；步骤2、对待检测样本基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并进行电泳分离鉴定；步骤3、于342bp处观察到条带，则该待测样本为黄腿螯蜂；否则，则该待测样本不是黄腿螯蜂。进一步地，所述PCR扩增体系如下：PCR体系25μL，包括ddH2O9.5μL、2*TaqPCRMasterMix：12.5μL、待检测样本DNA模板：1.0μL、引物CBYF:1.0μL、引物CBYR：1.0μL。进一步地，所述PCR扩增程序为：94℃下预变性5min，94℃下变性30s，62℃下退火30s，72℃下延伸1min，35个循环；循环结束后，72℃下延伸10min，最后反应终止在4℃。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术不需要传统分类相关领域的专业分类知识。2)本专利技术可以简单快速有效的在分子生物学水平对黄腿螯蜂进行分子鉴定。3)本专利技术成本低廉、操作简单、鉴定准确率高。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术设计黄腿螯蜂特异性引物用的4种螯蜂的Cytb基因比对结果；图2是是本专利技术黄腿螯蜂Cytb基因特异性引物的验证，其中，M：Marker；1：黄腿螯蜂；2：黑腹螯蜂；3：红螯蜂；4：双色螯蜂；5：褐飞虱；6：白背飞虱；7：灰飞虱；图3是本专利技术田间螯蜂样本检验结果，其中，M：Marker；1：L1；2：L2；3：L3；4：L4；5：L5；6：L6；7：P1；8：P2；9：P3；10：P4。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别方法的构建步骤1、采用杭州爱思进的AxyPrep基因组DNA小量试剂盒提取样本基因组DNA，具体操作如下：(1)将已经过形态学特征鉴定的1头黄腿螯蜂雌成虫、1头黑腹螯蜂雌成虫、1头红螯蜂雌成虫和1头双色螯蜂雌成虫，分别放入1.5ml离心管中，加入350μlBufferPBS和0.9μlRNaseA后充分研磨30s。(2)收集350μl研磨好的组织匀浆并转入2ml离心管。如匀浆体积不足350μl，补充PBS至350μl。加入150μlBufferC-L和20μl蛋白酶K。立即漩涡振荡1min混合均匀。短暂离心后,将离心管置56℃水浴10min。(3)加入350μlBufferP-D，漩涡振荡30s混合均匀，12,000×g离心10min。(4)将DNA制备管置于2ml离心管中，将步骤3中的混合液移至制备管中，12，000×g离心1min。(5)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500μlBufferW1，12，000×g离心1min。(6)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700μlBufferW2，12，000×g离心1min，以同样的方法，用700μlBufferW2再洗涤一次。(7)弃滤液，将制备管置回原来的2ml离心管中，12，000×g离心1min。(8)将DNA制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加100-200μlEluent或去离子水，室温静置1min，12，000×g离心1min洗脱DNA。离心管中液体即为基因组DNA。步骤2、PCR扩增体系的配制使用25μl的PCR反应体系，包括：2.5μl的10×PCRBuffer(Mg2+Free)、2μl的dNTPs(2.5mmol/L)、1.5μl的MgCl2(25mmol/L)、上游和下游引物(10μmol/L)各1μl(F：5’-TATGTACTACCATGAGGACAAATATC-3’，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，R：5'-ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT-3'，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示)、样品基因组DNA1μl、0.125μl的TaqDNAPolymerase，再加灭菌水补足25μl。步骤3、PCR扩增程序94℃5min；95℃30s、62℃20s、72℃1min(35个循环)；72℃5min；然后进行PCR扩增。步骤4、扩增产物测序将步骤3得到的扩增产物纯化后加入ABI3730XL测序仪中进行序列测定。步骤5、序列分析及特异性引物设计将样品序列导入GENEDOC软件中去掉多余序列后，分别得到序列Haplogonatopusatratus、序列Haplogonatopusjaponicas、序列Echthrodelphaxbicolor和序列Pseudogonatopusflavifemur。将4种螯蜂的序列进行比对分析(图1)，根据黄腿螯蜂与其他3种螯蜂序列的差异设计黄腿螯蜂的特异性引物CBYF5’-GGGTCTGATAATATGTATGGGT-3’，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；CBYR，5’-TTTTGGGGAGCAACAGTAAT-3’，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。步骤6、判定结果采用PCR体系25μL，包括ddH2O9.5μL、2*TaqPCRMaste本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物，其特征在于，包括CBYF和CBYR，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别引物，其特征在于，包括CBYF和CBYR，其序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。2.一种基于分子生物学的黄腿螯蜂的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、提取待检测样本的基因组DNA作为PCR的模板；步骤2、对待检测样本基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物并进行电泳分离鉴定；步骤3、于342bp处观察到条带，则该待测样本为黄腿螯蜂；否则，则该待测样本不是黄腿螯蜂。3.根据权利要求2...
【专利技术属性】
技术研发人员：田俊策，吕仲贤，王国荣，郑许松，徐红星，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。