一种与产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性相关的SNP标记及检测方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，公开了一种与产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性相关的SNP标记、其检测方法和用途。所述SNP标记位于猪13号染色体上的整合素受体蛋白ITGB5基因的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪13号染色体上g.145109683核苷酸位点，且具有为C/T多态性，所述SNP标记与产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性极显著相关。本发明专利技术提供的SNP标记与产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性相关，可以通过鉴定该SNP标记来筛选产肠毒素大肠杆菌F4型腹泻抗性猪品系，所得的腹泻抗性品系具有重要的经济效益与社会价值。

【技术实现步骤摘要】
一种与产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性相关的SNP标记及检测方法
本专利技术属于分子生物学
，涉及与产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性相关的SNP标记、其检测方法和用途。
技术介绍
当前畜牧业生产，畜禽传染病已经不仅仅是畜牧业发展的制约因素，亦已成为人类食品安全乃至人类健康的严重威胁。药物和疫苗作为防治畜禽传染病的主要手段，虽然发挥了关键作用，但在药物防治同时，病原微生物抗药性和变异也在同时增强，使得疾病预防和药物治疗的难度越来越大。如何摆脱畜牧生产对药物的过度依赖，减少抗生素的使用，从本质上提高畜禽自身免疫力和抗病力已成为当前畜牧业发展重中之重的问题，通过开发和利用新的分子选育标记来提高仔猪抗腹泻性能也倍受重视。仔猪腹泻是养猪生产中一种常见病和多发病，也是困扰规模化养猪生产的主要难题之一。引起仔猪腹泻的原因通常有大肠杆菌病、传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒感染等，其中，大肠杆菌是造成新生仔猪和断奶仔猪腹泻的最主要病原体。目前国际上公认的致病性大肠杆菌有五种，即致病性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌和肠集聚性大肠杆菌。引起新生或断奶仔猪被感染后腹泻死亡的主要是产肠毒素型大肠杆菌（ETEC），造成的死亡率约占仔猪腹泻死亡率的11％。尤其是F4产肠毒素大肠杆菌是导致仔猪断奶前腹泻的主要病原。大量研究表明仔猪对大肠杆菌易感和抗性是由于仔猪小肠上皮有无大肠杆菌菌毛受体基因决定的，其本质是菌毛与小肠上皮表面受体之间的识别过程。如有受体，大肠杆菌可特异性黏附到小肠上，抵御肠道蠕动和肠液冲刷，定居于小肠，繁殖产生大量毒素，引起小肠内水、电解质失去平衡，导致腹泻。仔猪小肠黏附受体的有无可通过小肠上皮细胞体外黏附试验来检测。同时，肠道受体的有无是由常染色体上多基因决定的，具有完全的显隐性关系，隐形纯合子表现为无受体，对大肠杆菌具有抗性。因此，通过鉴别出大肠杆菌F4受体基因，应用于标记辅助选择，培育出具有F4大肠杆菌抗性的新品系，降低养猪生产中由仔猪腹泻导致的经济损失和提高肉产品安全有着非常重要的意义。目前多数研究认为受体基因可能位于猪基因组（10.2版）13号染色体1Mb区间内，但仍无法确定真正的关键基因及其因果变异位点，大肠杆菌F4抗性调控机制至今还无可靠定论。因此，因此难以直接应用于仔猪腹泻抗性选育。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术不足，腹泻抗性仔猪选育难，提供与产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性相关的SNP标记。本专利技术的另一个目的在于提供用于检测上述SNP标记的引物和检测方法。本专利技术的另一个目的在于提供上述SNP标记的用途。一种与产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性相关的SNP标记，所述SNP标记位于猪猪13号染色体上的整合素受体蛋白ITGB5基因的核苷酸序列上，所述SNP标记的位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪13号染色体上g.145109683核苷酸位点，且具有为C/T多态性，所述SNP标记与产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性极显著相关。g.145109683位点具有TT基因型的仔猪腹泻抗性显著高于具有CC基因型的仔猪。一种基于本专利技术所述的SNP开发分子标记的方法，以含有本专利技术所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使本专利技术所述的SNP标记转化为分子标记。其中，所述的引物对序列为上游引物：SEQIDNO：2，下游引物：SEQIDNO：3；所述的分子标记序列如SEQIDNO：1所示，所述的SNP位点位于第194位，存在C/T多态性。按照本专利技术上述方法得到的分子标记。所述的分子标记优选序列如SEQIDNO：1所示，所述的SNP位点位于第194位，存在C/T多态性。一种用于检测所述的SNP标记的引物对，上游引物为：SEQIDNO：2，下游引物为：SEQIDNO：3。一种检测本专利技术所述的SNP标记的方法，包含PCR扩增猪基因组中含有本专利技术所述的SNP标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读该位点的C/T多态性。所述的检测本专利技术所述的SNP标记的方法，优选包括以下步骤：(1)取一头长白猪的耳组织样品并提取总DNA；(2)用已提取的猪基因组DNA为模板，使用所述的引物进行PCR扩增；(3)扩增产物进行测序，分析测序结果，判读在SEQIDNO：1第194位的C/T多态性。其中，步骤（2）所述的PCR扩增反应体系为：DNA模板1.0μL、SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示的引物各1.0μL、Taq酶试剂0.125μL、双蒸水17.38μL；其中所述DNA模板浓度为50ng/μL，所述引物的浓度为10mol/L，所述Taq酶为大连TaKaRa生物科技有限公司的试剂；PCR扩增的反应程序为：预变性95℃1min；变性95℃10s；退火60℃30s，延伸72℃30s，34个循环；延伸72℃5min。本专利技术所述的SNP标记、所述的分子标记、所述的引物在筛选产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性品系中的应用。一种筛选产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性品系的方法，包括检测仔猪g.145109683核苷酸位点的基因型，选育g.145109683核苷酸位点的TT型个体作为种猪。有益效果：本专利技术提供的SNP标记与产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性相关，因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选仔猪腹泻抗性品系，所得的腹泻抗性相关品系具有重要的经济效益与社会价值。附图说明图1为仔猪腹泻大肠杆菌F4受体全基因组关联分析的染色体水平显著SNP标记结果。其中，猪18条常染色体及X染色体信息标识于X轴。图2为使用本专利技术的引物扩增ITGB5基因的电泳图。图3为ITGB5基因的突变位点不同基因型的DNA测序结果峰图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和本质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例11、实验动物来源采自中国农业科学院昌平实验猪场。长白猪79头，大白猪203头，松辽黑猪86头，其中包括301头仔猪，共348头。2、粘附表型测定35日龄后屠宰采集小肠上皮组织进行大肠杆菌F4的粘附实验，分为粘附和不粘附两种类型。3、提取基因组DNA采集猪耳组织样品，放置于装有70%酒精的离心管内，-20℃冰箱保存备用。使用动物血液/组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，所需试剂包括：裂解液实验室配备蛋白酶K（德国MERCK生物科技有限公司）血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒：北京天根生物科技公司（TIANGEN）dNTPMixture(2.5mMeach)：宝生物工程(大连)有限公司10×PCRBuffer：宝生物工程(大连)有限公司Taq(5units/μL)：宝生物工程(大连)有限公司DNAMarker（DL2000，DL1000）：宝生物工程(大连)有限公司6×LoadingBuffer：宝生物工程(大连)有限公司琼脂糖：Gene有限公司TAE(50×)溶液：北京百泰克生物技术有限公司具体步骤如下所述：（1）取30mg左右耳组织于离心管中，剪碎，加200μL缓冲液GA，震荡。（2）加入20μLProteinaseK溶液，震荡混匀，放置于56℃水浴锅中消化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性相关的SNP标记，其特征在于所述SNP标记位于猪13号染色体上的整合素受体蛋白ITGB5基因的核苷酸序列上，所述SNP标记位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪13号染色体上g.145109683核苷酸位点，且具有为C/T多态性，所述SNP标记与仔猪产肠毒素大肠杆菌F4型腹泻抗性显著相关。

【技术特征摘要】
1.一种与产肠毒素大肠杆菌F4型仔猪腹泻抗性相关的SNP标记，其特征在于所述SNP标记位于猪13号染色体上的整合素受体蛋白ITGB5基因的核苷酸序列上，所述SNP标记位点为国际猪基因组10.2版本参考序列猪13号染色体上g.145109683核苷酸位点，且具有为C/T多态性，所述SNP标记与仔猪产肠毒素大肠杆菌F4型腹泻抗性显著相关。2.一种基于权利要求1所述的SNP开发分子标记的方法，其特征在于以含有权利要求1所述的SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以猪基因组DNA为模板进行PCR扩增，使权利要求1所述的SNP标记转化为分子标记。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的引物对序列为上游引物：SEQIDNO：2，下游引物：SEQIDNO：3；所述的分子标记序列如SEQIDNO：1所示，所述的SNP位点位于第194位，存在C/T多态性。4.按照权利要求2或3所述的方法得到的分子标记。5.根据权利要求4所述的分子标记，其特征在于分子标记序列如SEQIDNO：1所示，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘杨，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32