本发明专利技术属于基因工程技术领域，涉及一种转入淀粉酶基因的猪消化道瘤胃乳杆菌及其应用，按照转基因方法把来自枯草杆菌的淀粉酶基因转入到猪消化道瘤胃乳杆菌中，转基因的瘤胃乳酸杆菌转入猪胃肠道可在猪的胃肠道中大量繁殖，不仅起到微生态制剂的益生抑菌作用，而且又可分泌大量的淀粉酶，从而维持猪消化道内微生物平衡、抑制有害菌的生长、减少腹泻等消化道疾病发生，所产生的大量淀粉酶弥补了仔猪消化道结构不完善及分泌淀粉酶能力较弱的缺陷，提高了饲料中营养物质的消化率，达到了促进猪生长的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及一种转入淀粉酶基因的猪消化道 瘤胃乳杆菌及其应用。
技术介绍
仔猪是养猪生产的基础，是决定生产成本的关键，无论是哺乳仔猪或 断奶仔猪，由于其抗病弱、消化道不完善、死亡率高，从而对养猪业造成 巨大的经济损失，除饲养管理造成仔猪死亡外，由于消化不良和胃肠道菌 群紊乱所导致的生长停滞和死亡率居于首位。由于仔猪消化道结构不完善， 分泌淀粉酶能力较弱，易造成消化不良，为了弥补酶的不足，常常在仔猪料中添加淀粉酶，这样势必会增加饲养成本，经研究，利用16SrDNA技术 已经鉴别了瘤胃乳杆菌sWscj7^s r鹏j'/7is)是猪胃、小肠、大肠和 盲肠的优势乳酸菌，由乳酸菌等微生物产生的益生素在维持消化道内微生 物区系的平衡、抑制有害菌的生长、减少腹泻等消化道疾病发生及促生长 方面作用显著，如果能在乳酸菌中转入淀粉酶基因，靠瘤胃乳酸菌大量繁 殖，就能解决仔猪消化道分泌淀粉酶能力弱的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种转淀粉酶基因的猪消化道瘤胃乳杆菌的制备及其应用。转入淀粉酶基因的猪消化道瘤胃乳杆菌，是把来自枯草杆菌的淀粉酶基因转入到猪消化道瘤胃乳杆菌中，其制备步骤如下1、 制备枯草杆菌(^a'W^ s力^7A)的菌体DNA作为模板，2、 根据其基因文库中的淀粉酶基因的碱基序列，设计引物 正链为5， 一TCTAGACTGCATCAGGGCTGCGGCA;负链为5， 一CAAGCTTAATGAGGAAGAGAACCGCTTAAGC。3、 对淀粉酶基因进行PCR扩增反应，提取和纯化PCR产物。4、 利用Hind HI和Xbal两种核酸内切酶，分别处理可在大肠杆菌和 乳酸杆菌中表达的质粒(PHMSXDJ和PCR扩增的a-淀粉酶基因，分离质 粒和淀粉酶基因后，用QIAEX II纯化质粒和DNA片段。5、 利用T4 DNA连接酶把质粒(PHMSXD,)与淀粉酶基因连起来，构建 出 一个新的质粒载体(PHMSXD2)。6、 乳酸杆菌感受态细胞的准备瘤胃乳酸杆菌厌氧培养后，稀释，离 心，洗涤，定容。7、 转基因操作感受态细胞与质粒载体混合移入到电击槽内，利用高 压电击法，把质粒载体转入到瘤胃乳酸杆菌中。8、 转基因处理后的乳酸杆菌，加入培养液静止培养，然后涂抹到含有 淀粉和氨苄青霉素的MRS平皿上，厌氧培养。9、 菌落出现后，原位复制菌落，原菌落用碘液染色确定阳性菌落的位 置，从复制菌落中挑选阳性菌落，在含有淀粉的MRS厌氧培养液中培养。10、 测定厌氧培养液中淀粉酶的活力，加入15%的无菌甘油在-20或 -7(TC保存。含有淀粉酶的猪消化道瘤胃乳酸杆菌的使用方法一是按每公斤饲料加入的转淀粉酶基因的瘤胃乳酸杆菌(108个/ml),现用现配，适用于中大猪。二是采用口腔注入法，每次lOO)il，每周1-2次，适用于哺乳仔猪和小猪。利用16S rDNA技术鉴别出瘤胃乳杆菌aaWacj'〃ws n/则7 j's)是 猪胃、小肠、大肠和盲肠的优势乳酸菌，本专利技术通过把淀粉酶基因转入到 瘤胃乳杆菌中，把这种转基因的瘤胃乳杆菌词喂动物后，转基因的瘤胃乳 酸杆菌在猪的胃肠道中大量繁殖，它具有微生态制剂和酶制剂的双重功效， 不仅起到微生态制剂的益生抑菌作用，而且又可分泌大量的淀粉酶，由此 产生的益生素维持猪消化道内微生物区系的平衡、抑制有害菌的生长、减 少腹泻等消化道疾病发生，所产生的大量淀粉酶弥补了仔猪消化道结构不完善及分泌淀粉酶能力较弱的缺陷，提高了饲料中营养物质的消化率，从 而达到了促进猪生长的目的，转淀粉酶基因的瘤胃乳酸杆菌可完全替代抗生素，使仔猪的消化道疾病的发病率降低90%，日增重提高5-10%，饲料效率提高约10%。附图说明图1是转入淀粉酶基因的瘤胃乳杆菌菌落照片。淀粉酶酶活检测利用UNIC7200分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公 司制造。 具体实施例方式实施例1，淀粉酶基因转入猪消化道瘤胃乳杆菌采用以下步骤 1、制备枯草杆菌OfeciWiAS Si/Z77i'S)的菌体DNA作为模板(1) 枯草杆菌的培养培养液的组成为(g/L):胰蛋白胨2、酵母浸出物2、 Na風5.4、 KH2P04 2,4、 NaCl 2.0、可溶性淀粉10。在120。C下高 压灭菌20 min，高压灭菌后待冷至5(TC，再加入无菌的1M MgS04 2 ml和 100 mM CaCl2 1 ml。培养条件是37°C，在250 r/min的旋转式培养箱中 培养16小时。贮存条件为加入无菌甘油使其浓度为15%,混匀后于-70°C保存。(2) 从枯草杆菌中提取菌体DNA取5 ml培养16小时的枯草杆菌培养液，置于离心管内，在转速为 1500Xg下，离心10min。用1 ml TE (50mMTris-HCl ， lOmMEDTA， pH8.0) 悬浮菌体。利用0. 2 ml裂解酶(Lysozyme， 5 mg/ml)和RNA酶(0. 1 mg/ml) 在37。C下作用15 min。加入0. 2 ml TE、 20 W 10% SDS及5 W蛋白酶K (10 mg/ml)，在55。C下作用30 min后，置于37。C，反应2 h。利用苯酚 氯仿(V/V，l: 1)混合物浸提3次，最后用乙醇沉淀来制备菌体DNA。2、根据其基因文库中的淀粉酶基因的碱基序列，设计引物及PCR扩增 淀粉酶基因正链，5， 一TCTAGACTGCATCAGGGCTGCGGCA; 负链，5， 一CAAGCTTAATGAGGAAGAGAACCGCTTAAGC。PCR扩增反应物(总体积为50 W)组成如下模板DNA 250 ng、每 个引物100 pmol、 5 W缓冲剂、5U Taq DNA聚合酶、12. 5mMMgCl2、各20uM dNTPS，最后用去离子水调节体积至50 Pl。 PCR的循环程序为95°C、 5 min—36个循环(95°C、 15 sec—56°C、 30 sec—68。C、 3 min) —72°C、 5 min—维持于4。C。禾U用Gene AMP PCR System 2400 (Perkin Elmer， US) 进行PCR扩增反应。3、载体构建利用Hind III和Xbal两种核酸内切酶，分别处理质粒(P歷SXDi )和PCR扩增的a -淀粉酶基因。在37°C下分别处理质粒(P丽SXD,) 和PCR扩增的ex-淀粉酶基因16 h。消化处理后的质粒再用犊牛肠磷酸酶 5ul (1 U/ul)处理30 min，以防质粒再环状化。利用0. 8%琼脂糖电泳 分离质粒和淀粉酶基因，最后用QIAEX II Kits (Germany)纯化质粒和DNA片 段。在16。C的条件下，利用T4 DNA连接酶把质粒(PHMSXD, ， 3. 26 kb)与 淀粉酶基因(2.3kb)连起来，处理10小时，构建出一个新的质粒载体(P丽SXD2，5.56 kb)。其中含有抗氨苄青霉素基因，pSP72复制因子及淀粉 酶基因(含有来自于枯草杆菌淀粉酶基因的调控区、信号肽、功能基因和 终止因子)。4、 乳酸杆菌感受态细胞的准备利用厌氧培养基(MRS),在37C下 厌氧培养瘤胃乳酸杆菌12h，然后用添加有20 mM苏氨酸的MRS溶液稀释 100倍，低温超速离心本文档来自技高网...
【技术保护点】
转入淀粉酶基因的猪消化道瘤胃乳杆菌，其特征在于，把来自枯草杆菌的淀粉酶基因转入到猪消化道瘤胃乳杆菌中，其制备步骤如下：（１）、制备枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）的菌体ＤＮＡ作为模板，（２）、根据其基因文库中的淀粉酶基因的碱基序列，设计引物：正链为５’－ＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＧＧＣＡ；负链为５’－ＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＧＣＴＴＡＡＧＣ。（３）、对淀粉酶基因进行ＰＣＲ扩增反应，提取和纯化ＰＣＲ产物。（４）、利用ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａⅠ两种核酸内切酶，分别处理可在大肠杆菌和乳酸杆菌中表达的质粒（ＰＨＭＳＸＤ↓［１］）和ＰＣＲ扩增的α－淀粉酶基因，分离质粒和淀粉酶基因后，用ＱＩＡＥＸⅡ纯化质粒和ＤＮＡ片段。（５）、利用Ｔ↓［４］ＤＮＡ连接酶把质粒（ＰＨＭＳＸＤ↓［１］）与淀粉酶基因连起来，构建出一个新的质粒载体（ＰＨＭＳＸＤ↓［２］）。（６）、乳酸杆菌感受态细胞的准备：瘤胃乳酸杆菌厌氧培养后，稀释，离心，洗涤，定容。（７）、转基因操作：感受态细胞与质粒载体混合移入到电击槽内，利用高压电击法，把质粒载体转入到瘤胃乳酸杆菌中。（８）、转基因处理后的乳酸杆菌，加入培养液静止培养，然后涂抹到含有淀粉和氨苄青霉素的ＭＲＳ平皿上，厌氧培养。（９）、菌落出现后，原位复制菌落，从复制菌落中挑选阳性菌落，在含有淀粉的ＭＲＳ厌氧培养液中培养后即得产物。...
【技术特征摘要】
1、转入淀粉酶基因的猪消化道瘤胃乳杆菌，其特征在于，把来自枯草杆菌的淀粉酶基因转入到猪消化道瘤胃乳杆菌中，其制备步骤如下(1)、制备枯草杆菌(Bacillus subtilis)的菌体DNA作为模板，(2)、根据其基因文库中的淀粉酶基因的碱基序列，设计引物正链为5’-TCTAGACTGCATCAGGGCTGCGGCA；负链为5’-CAAGCTTAATGAGGAAGAGAACCGCTTAAGC。(3)、对淀粉酶基因进行PCR扩增反应，提取和纯化PCR产物。(4)、利用Hind III和Xba I两种核酸内切酶，分别处理可在大肠杆菌和乳酸杆菌中表达的质粒(PHMSXD1)和PCR扩增的α-淀粉酶基因，分离质粒和淀粉酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：尹清强，郑秋红，路玲，程伟，陈文，姜义宝，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]
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