用于肉品保鲜的抗菌剂制造技术

本发明专利技术公开了一种用于肉品保鲜的抗菌剂，其包括：卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)K313的S层蛋白SlpB和乳酸链球菌素。本发明专利技术所述用于肉品保鲜的抗菌剂能够利用卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB与乳酸链球菌素Nisin协同作用，增强对肉品中常见腐败菌腐生葡萄球菌的抑制作用，用于肉品保鲜，延长货架期。

Antimicrobial agent for meat preservation

The invention discloses an antibacterial agent, meat preservation includes: Lactobacillus plantarum (Lactobacillus crispatus) K313 S layer protein SlpB and nisin. The antibacterial agent for meat preservation can make use of Lactobacillus plantarum K313 S protein SlpB and nisin Nisin synergistic effect, enhance the inhibitory effect of common spoilage bacteria of Staphylococcus saprophyticus in meat and for meat preservation, prolong the shelf life.

【技术实现步骤摘要】
用于肉品保鲜的抗菌剂
本专利技术涉及肉及肉制品的保鲜领域。更具体地说，本专利技术涉及一种用于肉品保鲜的抗菌剂。
技术介绍
肉及肉制品蛋白质和脂肪含量丰富，水活度较高，在加工、运输和贮存过程中易受到微生物的侵染而腐败变质。为延长肉品的货架期，利用防腐抗菌剂抑制或杀灭腐败微生物是有效的方法之一。随着肉类食品安全问题的突出和人们对健康的重视，生物防腐抗菌剂越来越受到企业和消费者的青睐。但是生物抗菌剂的抑菌范围相对较窄，常不能单一地使用，需要与其它抗菌剂联合使用。如Nisin乳酸链球菌素是目前应用最广泛的抗菌剂，但是它有效抑菌浓度较高且仅在低pH时有效，鉴于其在应用上的局限性，开发新的生物抗菌剂或者增效剂具有较强的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术基于意想不到的发现，即卷曲乳杆菌S层蛋白SlpB与乳酸链球菌素Nisin协同作用时，能够杀死腐生葡萄球菌。本专利技术还有一个目的是提供一种用于肉品保鲜的抗菌剂，其能够利用卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB与乳酸链球菌素Nisin协同作用，增强对肉品中常见腐败菌腐生葡萄球菌的抑制作用，用于肉品保鲜，延长货架期。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种用于肉品保鲜的抗菌剂，包括：一种用于肉品保鲜的抗菌剂，其包括：卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)K313的S层蛋白SlpB和乳酸链球菌素Nisin。S层(Surfacelayer)是存在于细菌及古细菌细胞外由蛋白或糖蛋白亚单位组成的单分子层晶格状结构。S-层蛋白的功能包括:维持细胞的形态结构、吸附小分子和离子、黏附或免疫调节等。我们研究发现SlpB通过损伤细胞壁，使Nisin易进入细胞膜，起到穿孔作用，从而协助Nisin杀死细菌。二者协同作用能显著抑制S.saprophyticusP2的生长。优选的是，所述用于肉品保鲜的抗菌剂包括：30-50重量份的卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB以及100-500重量份的乳酸链球菌素。优选的是，所述用于肉品保鲜的抗菌剂包括：40重量份的卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB以及250-500重量份的乳酸链球菌素。研究发现，按照重量份进行如本专利技术所述配比后，二者的协同作用最优，杀菌效果最好。优选的是，所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB通过以下步骤制备：(1)以卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)K313基因组DNA为模板，利用如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列和如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列进行PCR扩增，得到包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的基因片段，之后将该基因片段构建到pET-22b表达载体上得到重组载体pET-Slpb；(2)将构建好的重组载体pET-Slpb以CaCl2法转化到大肠杆菌E.coliBL21中，构建重组菌株，之后利用该重组菌株进行诱导表达，然后通过进行蛋白纯化，得到所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB，所述SlpB的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。利用工程菌株例如大肠杆菌进行异源表达，然后制备所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB。该方法可以提高所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB的制备量，同时更容易纯化。优选的是，所述PCR扩增程序依次包括：94℃预变性4min；94℃变性40s，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。优选的是，利用该重组菌株进行诱导表达，然后通过进行蛋白纯化，制得的卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB的方法包括：步骤一，挑取重组菌株单菌落于含抗生素的LB培养基中，37℃摇动培养过夜；将过夜培养物按2％的接种量转接到含抗生素的新鲜LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.8；加入终浓度为1.0mM的IPTG诱导表达，18℃继续培养4h；步骤二，5000-10000g离心5min收集诱导表达的大肠杆菌，用PBS缓冲液洗两遍，用1/10体积的Bindingbuffer缓冲液重悬菌体；将菌体置于冰水混合物中超声破碎，然后4℃，10000-15000g离心30min，上清液即为大肠杆菌可溶性蛋白成分；步骤三，纯化：用0.22μm滤膜过滤上清液；用5倍柱体积的水冲洗HisTrapTMFFcrudecolumns，流速为1mL/min；用5倍柱体积的Bindingbuffer缓冲液平衡柱子；将所述上清液用针头吹打后上样，以打断样品中的DNA分子，之后用10倍体积的Bindingbuffer缓冲液冲洗柱子；用10倍体积的Washingbuffer缓冲液冲洗柱子，洗掉未结合的蛋白样品；用5倍体积的Elutionbuffer缓冲液洗脱，将纯化的蛋白置于磷酸盐缓冲液中进行梯度透析，去除咪唑及盐离子，制得卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB。纯化的蛋白浓度用Bradford蛋白定量试剂盒定量。优选的是，所述超声破碎时，超声强度为25-30％，超声功率为300-400W，超声工作时间5s，停歇时间5s，处理99次，两个循环。优选的是，所述Bindingbuffer缓冲液包含：20mM磷酸盐缓冲液，500mMNaCl以及25mM咪唑，pH7.4；所述Washingbuffer缓冲液包含：20mM磷酸盐缓冲液，500mMNaCl以及50mM咪唑，pH7.4；所述Elutionbuffer缓冲液包含：20mM磷酸盐缓冲液，500mMNaCl以及500mM咪唑，pH7.4。本专利技术至少包括以下有益效果：本专利技术所述用于肉品的抗菌剂选用卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB与Nisin两种组分进行混合制备。利用卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB与Nisin的协同作用，不仅可以抑制腐生葡萄球菌S.saprophyticusP2的生长，同时SlpB通过损伤S.saprophyticusP2的表面增强Nisin的杀菌作用；二者共同作用造成细胞的死亡。所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB的制备采用工程菌株进行异源表达，其制备方法简单，产量大，容易纯化。本专利技术所述用于肉品的抗菌剂利用卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB与Nisin的协同作用，增强对肉品中常见腐败菌腐生葡萄球菌的抑制作用，增强杀菌作用，应用于肉品保鲜，延长货架期。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为利用本专利技术各实施例中所述用于肉品保鲜的抗菌剂处理后的S.saprophyticusP2生长曲线图；图2为利用本专利技术各实施例中所述用于肉品保鲜的抗菌剂处理后的S.saprophyticusP2的扫描电镜图；图3为利用本专利技术各实施例中所述用于肉品保鲜的抗菌剂处理后的S.saprophyticusP2的透射电镜图；图4为利用本专利技术各实施例中所述用于肉品保鲜的抗菌剂处理后的S.saprophyticusP2胞内和胞外ATP的含量曲线图；图5为利用本专利技术各实施例中所述用于肉品保鲜的抗菌剂处理后的S.saprophyticusP2的群体效应图；图6为利用本专利技术各实施例中所述用于肉品保鲜的抗菌剂处理后的S.saprophyticusP2膜电势差的变化图。具体实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，包括：卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)K313的S层蛋白SlpB和乳酸链球菌素。

【技术特征摘要】
1.一种用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，包括：卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)K313的S层蛋白SlpB和乳酸链球菌素。2.如权利要求1所述的用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，包括：30-50重量份的卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB以及100-500重量份的乳酸链球菌素。3.如权利要求2所述的用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，包括：40重量份的卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB以及250-500重量份的乳酸链球菌素。4.如权利要求1所述的用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB通过以下步骤制备：(1)以卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)K313基因组DNA为模板，利用如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列和如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列进行PCR扩增，得到包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的基因片段，之后将该基因片段构建到pET-22b表达载体上得到重组载体pET-Slpb；(2)将构建好的重组载体pET-Slpb以CaCl2法转化到大肠杆菌E.coliBL21中，构建重组菌株，之后利用该重组菌株进行诱导表达，然后通过进行蛋白纯化，得到所述卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB，所述SlpB的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。5.如权利要求4所述的用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，所述PCR扩增程序依次包括：94℃预变性4min；94℃变性40s，52℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。6.如权利要求4所述的用于肉品保鲜的抗菌剂，其特征在于，利用该重组菌株进行诱导表达，然后通过进行蛋白纯化，制得的卷曲乳杆菌K313的S层蛋白SlpB的方法包括：步骤一，挑取重组菌株单菌落于含抗生素...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙芝兰，刘芳，王道营，王筱梦，诸永志，吴海虹，张新笑，徐为民，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32