HLA相关的SNP标记及其检测引物对与确定方法技术

本发明专利技术提供一种HLA相关的SNP标记及其检测引物对与确定方法；旨在为移植风险评估提供一种引物与方法，其技术方案包括HLA相关的SNP标记，SNP标记为人6号染色体32610275位置的碱基C或T；一种用于检测权利要求1所述的SNP标记引物对具有SEQ ID NO:1‑2或SEQ ID NO:3‑4所示的核苷酸序列；上述的SNP位点的确定方法，包括步骤：1)提取宿主细胞的基因组DNA；2)将模板DNA进行PCR扩增，并将PCR产物SAP/Exon I纯化；3)纯化后的PCR产物用测序引物分别进行正向和/或反向测序扩增，测序产物纯化，ABI 3730xl毛细管电泳测序，从而确定SNP位点及其基因型。

HLA related SNP markers and their detection primer pairs and determination methods

The invention provides a SNP marker related to HLA and its detection primer and the determination method; to provide a primer and method for transplantation of risk assessment, the technical scheme includes SNP labeled HLA, SNP labeled C base on chromosome 6 at position 32610275 or T; a nucleotide sequence for the detection of claim 1 the SNP of SEQ ID primers NO:1 2 or SEQ ID NO:3 4 shows; the SNP method to determine the site comprises the following steps: 1) extracting genomic DNA of host cells; 2) the DNA template was amplified by PCR, and the PCR product of SAP/Exon I purification; 3) PCR products were purified by sequencing primers were positive and / or reverse sequencing of PCR product purification, sequencing, ABI capillary electrophoresis 3730xl sequencing to determine SNP loci and genotypes.

【技术实现步骤摘要】
HLA相关的SNP标记及其检测引物对与确定方法
本专利技术涉及医学
，具体涉及一种与HLADQ启动子相关的SNP标记分析，并通过这一SNP标记预测患者器官移植后排斥风险评估。
技术介绍
在器官移植领域中，由HLA抗体介导的体液免疫引起的各类排斥反应是影响移植后人/移植物存活的最关键因素。SNP(Singlenucleotidepolymorphism，单核苷酸多态性)主要是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。在人群中，HLA(Humanleukocyteantigen，人类白细胞抗原)具有丰富的多态性，在器官移植中，供体器官内皮细胞中的HLA抗原常常作为识别抗原，引起一系列的排斥反应，影响这器官移植的人/器官存活率。另外HLA本质是MHC(Majorhistocompatibilitycomplex，主要组织相容性复合体)，在受体中具有提呈外来抗原的作用。在器官移植领域，对于供体来说，DQ表达量越低，其在细胞表面的DQ蛋白含量就越低，越难被受体的MHC提呈。而对于患者来说，DQ表达量越低，其抗原提呈能力越低，免疫状态也越低下。基于此原理，供受体DQ表达量越低越有利于器官移植的进行。研究报道，机体正常情况下，DQ的本底表达量较低，此时机体只利用HLAI类位点和DR位点提呈外来抗原。当机体的免疫状态被激活时，DQ表达量会迅速上升，产生大量的DQ蛋白，以较高的亲和力提呈外来抗原物质，激活机体的T/B淋巴细胞，杀伤外来入侵物质。而DQ蛋白的高亲和力，一方面使其更容易的提呈外来入侵抗原，但另一方面，过高的亲和力使其很容易提呈到自身蛋白，从而产生抗体攻击自身细胞，产生自身免疫病。据此前的文章报道，DQ启动子中某些转录激活区单核苷酸的改变，将使相关转录因子的结合能力受影响，从而影响DQ蛋白在各时期的调控。而位于人类第6号染色体中DR和DQ基因之间的32610275碱基是影响DQ表达量最为重要的SNP，32610275位置的碱基T时，DQ表达量较高，而当32610275位置的碱基C时，则DQ表达量较低。基于以上原理，我们通过测量患者的DQ的启动子以上位点的SNP，即可得知患者抗原提呈的能力，从而预测患者器官移植后发生体液排斥的风险。在目前的器官移植临床中，因为供体的缺乏，供受体间HLA抗原很难完全匹配。通过DQ启动子SNP的检测，我们可以将DQ表达量低的患者配型要求降低，使患者更为容易的找到供体，减少手术等待时间；对于DQ表达量高的患者，可以提高配型的要求，减少患者术后发生排斥的风险，从而造福移植患者。然而，目前还没有将DQ启动子SNP分析应用于器官移植的临床报道，若能通过分析DQ启动子SNP，明确患者在免疫状态下DQ蛋白的表达量，就能通过患者的抗原提呈能力预测术后产生体液排斥的风险，推动我国器官移植排斥反应的早期预测的现状，并指导临床中供体的选择，免疫抑制剂用量等。因此，通过对HLA的II类DQ位点超级启动子区SNP分子标记的研究，可以为移植排斥风险提供一种新的辅助评估手段，具有较强的临床指导意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种HLADQ启动子SNP位点的确定及分型方法及其应用，为移植风险评估提供一种补充手段。为解决上述技术问题，本专利技术的一组HLA相关SNP位点，是人6号染色体HLA基因区第32610275位的C/T多态(ATGCCCTTC(C/T)CTTTTAAAACTG)，具有SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。本专利技术的HLA相关SNP位点的确定方法，包括步骤：1)提取宿主细胞的基因组DNA；2)将模板DNA进行PCR扩增，并将PCR产物SAP/ExonI纯化；3)纯化后的PCR产物用测序引物分别进行正向和/或反向测序扩增，测序产物纯化，ABI3730xl毛细管电泳测序，从而确定SNP位点及其基因型。进一步的，上述的HLA相关SNP位点的确定方法，其特征在于：步骤2)所述的PCR扩增时：上游引物：5'TAATTGAGATAATACACCTGGAAG3'(SEQIDNO.1)下游引物：5'GTGAGAAGAATGGCTGACG3'(SEQIDNO.2)。进一步的，上述的HLA相关SNP位点的确定方法，其特征在于：步骤2)所述的PCR扩增时：上游引物：5'CTTTGAATTTAGGCAGAACG3'(SEQIDNO.3)下游引物：5'GCAGCATCACTTGTCTCC3'(SEQIDNO.4)。进一步的，上述的HLA相关SNP位点的确定方法，步骤3)所述的PCR扩增产物正向测序引物5'TAATTGAGATAATACACCTGGAAG3'(SEQIDNO.1)；或/和反向测序引物：5'GTGAGAAGAATGGCTGACG3'(SEQIDNO.2)进一步的，上述的HLA相关SNP位点的确定方法，其特征在于：步骤3)所述的PCR扩增产物正向测序引物5'CTTTGAATTTAGGCAGAACG3'(SEQIDNO.3)；或/和反向测序引物：5'GCAGCATCACTTGTCTCC3'(SEQIDNO.4)。进一步的，上述的HLA相关SNP位点的确定方法，其特征在于：步骤2)PCR扩增时反应体系以20ul计为：50-100ng/ul模板DNA1ul，10pmol/ul上游引物和下游引物各1ul，2×PCRSolutionPremixTaqTM10ul，余量为双蒸水；进一步的，上述的HLA相关SNP位点的确定方法，其特征在于：步骤2)PCR扩增时PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃30秒，51℃30秒，72℃45秒，35个循环；72℃5分钟；4℃∞。本专利技术的一组HLA相关SNP位点，在DQ超级启动子转录激活区，该区域的单核苷酸改变，将使相关转录因子的结合能力受影响，从而提高或降低DQ蛋白在各时期的表达量。另外，SNP位点碱基为T突变型的患者，DQ表达量也较高。因此可以通过对这组SNP位点的基因多态性分析，来辅助移植排斥风险和自身免疫疾病的评估。附图说明图1是本专利技术实施例1提供的SNP标记位点琼脂糖凝胶电泳图。图2是本专利技术实施例1提供的SNP标记位点的基因型测序峰图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为本专利技术的限制。实施例1一组HLA相关SNP标记的获得1.1实施例1血液样本的获得实施例1血液样本为中山大学附属第一医院，器官移植科采集的肾移植患者移植前的全血样本中随机抽取的6个血样，用于基因组DNA提取。1.2实施例1血液样本基因组DNA提取本试验采用TIANampBloodDNAKit(目录号：DP348)对实施例1血液样本进行基因组DNA提取，具体步骤如下：(1)将实施例1六例患者全血样本轻柔颠倒混匀，并从中吸取200ul到一个新的1.5mlEP管(如果DNA提取浓度过低，亦可将血样500g，5min离心分层，取中间的白膜层细胞200ul进行后续提取操作)。(2)向(1)中EP管加入200ul的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀，向细胞核沉淀中加200ul缓冲液GS，振荡至彻底混匀。(3)加入200ul缓冲液GB和20ulProteinaseK的预混溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
HLA相关的SNP标记，其特征在于，SNP标记为人6号染色体32610275位置的碱基C或T(SEQ ID NO.5)。

【技术特征摘要】
1.HLA相关的SNP标记，其特征在于，SNP标记为人6号染色体32610275位置的碱基C或T(SEQIDNO.5)。2.用于检测权利要求1所述的SNP标记引物对，其特征在于，引物对具有SEQIDNO:1-2或SEQIDNO:3-4所示的核苷酸序列。3.HLA相关SNP位点的确定方法，包括步骤：1)提取宿主细胞的基因组DNA；2)将模板DNA进行PCR扩增，并将PCR产物SAP/ExonI纯化；3)纯化后的PCR产物用测序引物分别进行正向和/或反向测序扩增，测序产物纯化，ABI3730xl毛细管电泳测序，从而确定SNP位点及其基因型。4.如权利要求3所述的HLA相关SNP位点的确定方法，其特征在于：步骤2)所述的PCR扩增引物为：上游引物：5'TAATTGAGATAATACACCTGGAAG3'(SEQIDNO.1)下游引物：5'GTGAGAAGAATGGCTGACG3'(SEQIDNO.2)。5.如权利要求3所述的HLA相关SNP位点的确定方法，其特征在于：步骤2)所述的PCR扩增引物为：上游引物：5'CTTTGAATTTAGGCAGAACG3'(SEQIDNO.3)下游引物：5'GCAGCATCACTTGTCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：余小林，姚远，何润钧，
申请(专利权)人：广州博富瑞医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44