犬类多重遗传病筛查的方法、引物和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种犬类多重遗传病筛查的方法，所述方法包括步骤：1)获取来自犬的含有DNA的样品；2)从所述含有DNA的样品中提取DNA；3)构建二代测序文库，得到含有需要检测的71个DNA靶点的DNA片段，使用的引物如下：SEQ ID NO.1‑142，其中所述引物每两个依次组成正向引物和反向引物；4)对文库进行测序；5)分析测序数据，得到71个疾病位点的DNA突变情况；6)根据突变情况预测或者诊断疾病。本发明专利技术还公开了用于犬类多重遗传病筛查的引物和试剂盒。

Methods, primers and kits for screening multiple hereditary diseases in dogs

The invention discloses a method for canine multiple genetic screening, the method includes the steps of: 1) to obtain DNA containing samples from dogs; 2) to extract DNA from the DNA containing samples; 3) construction of the two generation sequencing library, containing 71 DNA need to detect the target DNA fragments using primers as follows: SEQ ID NO.1 142, wherein each of the two primers were composed of forward and reverse primers; 4) sequencing of cDNA library; 5) analysis of sequencing data, 71 disease loci DNA mutation; 6) according to the mutation prediction or diagnosis of disease. The invention also discloses the primers and kits for screening multiple hereditary diseases in dogs.

【技术实现步骤摘要】
犬类多重遗传病筛查的方法、引物和试剂盒
本专利技术属于基因检测领域，特别涉及一种犬类多重遗传病筛查的方法和试剂盒。
技术介绍
犬类遗传病筛查的方法目前主要分为两大类，第一类：通过临床表征结合生化实验方法对犬类遗传病进行诊断；第二类：通过PCR和Sanger测序对引起遗传病的突变位点记性鉴定。上述两类产品的技术缺点如下：第一类：1)只有疾病发作时才能检测出来，往往丧失了预防，延缓以及治疗的黄金时间；2)很多遗传疾病在发病期症状很相似，甚至在做完很多种临床表征检查或者生化检测后都很难确诊出具体病症；3)犬类不像人类可以用语言描述其真实感受，给疾病确诊带来了更大的挑战。第二类：1)PCR和Sanger测序的成本很高，如果犬类需要全面筛查几十甚至上百种遗传病，往往成本太大而难以实现(现有单个遗传病检测的价格从199到1500元不等)2)全面筛查多种疾病的时候需要大量的犬类唾液或者血液样本，给采样带来很多麻烦。因此，本领域中需要一种犬类多重遗传病筛查的方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术通过唾液DNA提取，加上靶向高通量测序试剂盒，来达到对71个疾病位点的检测。因此，在第一方面，本专利技术提供了一种犬类多重遗传病筛查的方法，所述方法包括步骤：1)获取来自犬的含有DNA的样品；2)从所述含有DNA的样品中提取DNA；3)构建二代测序文库，得到含有需要检测的71个DNA靶点的DNA片段，使用的引物如下：4)对文库进行测序；5)分析测序数据，得到71个疾病位点的DNA突变情况；6)根据突变情况预测或者诊断疾病。在一个实施方案中，所述含有DNA的样品为来自犬的唾液。在一个实施方案中，在步骤4)中使用Illumina二代测序仪进行测序。在第二方面，本专利技术提供了一种犬类多重遗传病筛查的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：SEQIDNO.1-142，其中所述引物每两个依次组成正向引物和反向引物。在一个实施方案中，所述试剂盒还包括获取来自犬的含有DNA的样品的试剂，所述样品优选为唾液。在一个实施方案中，所述试剂盒还包括从样品中提取DNA的试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒还包括对文库进行测序的试剂。在第三方面中，本专利技术还提供了一种犬类多重遗传病筛查的引物组，所述引物组包括如下引物：SEQIDNO.1-142，其中所述引物每两个依次组成正向引物和反向引物。本专利技术的优点在于：与现有方案一相比，用DNA信息进行疾病诊断，所以准确并且有预见性，可以在疾病发病前检测出来患病风险。与现有方案二相比，因为可以通过二代测序平台同时检测多个位点，从而极大的降低了成本，提高了检测速度，并减少了对初始DNA样本量的要求。应当理解，前述大体的描述和后续详尽的描述均为示例性说明和解释，并不应当用作对本专利技术所要求保护内容的限制。具体实施方式在本专利技术中，本专利技术人发现犬类基因组上71个位点与疾病相关，为了检测这71个位点，专利技术人首先获得了71个DNA序列，通过这些序列可以唯一定位相应位点，这71个DNA序列和相应突变位点。在本专利技术中，对于每个位点的而言，使用引物设计均能设计数十种引物进行相应位点的检测，本专利技术为了将这70组引物在一个试剂盒中进行检测，经过了繁琐的实验验证，发现长度为18-25的引物彼此干扰最小，因此每个位点的引物中选择这个长度范围的引物进行进一步测定，对于没有这个范围引物的位点，选择最接近这个范围的3对引物进行测定。同时，专利技术人考虑了不同位点的引物之间的序列相似性，将每个序列与其他选中序列的平均相似性定在20％，并且与任一其他选中序列的相似性不大于40％，以下并且越小越优选。选中了如下序列：在本专利技术中，对于SEQIDNO.X而言，X为奇数为正向引物，X为偶数则为反向引物。本专利技术的方法与现有方案一相比，用唾液或者血液中的DNA信息进行疾病诊断。与现有方案二相比，设计出可以在同一反应进行扩增的PCR引物，通过二代测序平台同时检测多个位点。通过参考示范性实施例，本专利技术的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本专利技术并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本专利技术的具体细节。实施例本实施例中，实验步骤如下：1.取得4只犬的唾液样品(编号犬1-4)。提取唾液样品的步骤如下1)使用PuritanSterileRayonTippedapplicator采样棉签。将棉签头插入犬只上嘴唇和上牙龈之间，按住上嘴唇，轻轻转动棉签头10次。2)取出棉签,不要让棉签头接触任何污染源。3)晾干棉签15分钟。2.提取从所述唾液样品分别提取DNA。使用赛默飞(ThermoFisher)的gDNABuccalCellKit试剂盒从棉签中提取犬类DNA(步骤参照产品说明书)。3.用本专利技术的引物，构建二代测序文库，得到含有需要检测的70个DNA靶点的DNA片段(多重PCR+二代测序减少了实验成本，提高了实验速度)。本专利技术的引物通过Igenetech提供，构建文库的步骤如下使用IlluminaTrueSeqlibraryprepkit进行建库。4.用Illumina二代测序仪对文库进行测序。测序在Igenetech进行，使用的是IlluminaHiseq2000…测序仪。5.分析测序数据，得到71个疾病位点的DNA突变情况。其中，犬2在“多重药物敏感”位点处携带致病基因；犬4在“鱼鳞病”位点处携带致病基因。犬2和犬4的其他70个位点正常；犬1和犬3在全部71个位点正常。6.验证选取71个位点数据的样品通过PCR和Sanger测序进行验证。结果这71个位点的测序结果与用步骤5中的结果完全一致。结合这里披露的本专利技术的说明和实践，本专利技术的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本专利技术的真正范围和主旨均由权利要求所限定。SEQUENCELISTING<110>深圳深知生物科技有限公司<120>犬类多重遗传病筛查的方法、引物和试剂盒<130>ZZ2017146SZ-P<160>142<170>PatentInversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>1cacttgtcatgcaacctgactgtcc25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>2gggaagctggtttccgtgatatcat25<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>3ctccatgaatttttcactcaccaat25&lt本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种犬类多重遗传病筛查的方法，所述方法包括步骤：1)获取来自犬的含有DNA的样品；2)从所述含有DNA的样品中提取DNA；3)构建二代测序文库，得到含有需要检测的71个DNA靶点的DNA片段，使用的引物如下：SEQ ID NO.1‑142，其中所述引物每两个依次组成正向引物和反向引物；4)对文库进行测序；5)分析测序数据，得到71个疾病位点的DNA突变情况；6)根据突变情况预测或者诊断疾病。

【技术特征摘要】
1.一种犬类多重遗传病筛查的方法，所述方法包括步骤：1)获取来自犬的含有DNA的样品；2)从所述含有DNA的样品中提取DNA；3)构建二代测序文库，得到含有需要检测的71个DNA靶点的DNA片段，使用的引物如下：SEQIDNO.1-142，其中所述引物每两个依次组成正向引物和反向引物；4)对文库进行测序；5)分析测序数据，得到71个疾病位点的DNA突变情况；6)根据突变情况预测或者诊断疾病。2.根据权利要求1所述的方法，所述含有DNA的样品为来自犬的唾液。3.根据权利要求1所述的方法，在步骤4)中使用Illumina二代测...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘毓文，杨承，耿灿，
申请(专利权)人：深圳深知生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44