检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物及试剂盒，本发明专利技术试剂盒包括探针组合物，该探针组合物包括20q12探针，5P15.2探针，EGR1探针，CSPY探针，CSP8探针，CSP7探针和D7S486探针。本试剂盒可对同一骨髓增生异常综合症病人骨髓细胞进行7种基因的同时检测，显著提高了检测能力和效率。

Chromosome and gene probe composition and kit for the detection of myelodysplastic syndrome

【技术实现步骤摘要】
检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物及试剂盒
本专利技术涉及一种染色体和基因探针组合物及试剂盒，尤其涉及一种检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物及试剂盒。
技术介绍
骨髓增生异常综合症(MDS)是一组异质性的造血干祖细胞恶性克隆性疾病，以骨髓细胞异常增殖、分化、成熟，骨髓衰竭，细胞凋亡增加、髓系一系或多系血细胞减少，无效造血以及急性髓细胞性白血病(AML)转化风险增高为主要特征。在MDS中，异常的造血干祖细胞恶性增殖，其子代细胞迅速侵占整个骨髓，且该细胞仍然保持着成熟的能，但其凋亡能力也增强，即过度凋亡，故临床上表现为无效造血及外周血细胞减少。由于MDS的异质性，不同的MDS患者有不同的临床表现，而临床表现的多样性可能是因为不同的患者有不同的染色体异常的类型。临床上大约有40％-60％的MDS患者有染色体的异常，其中以5q的缺失(5q-)、5号染色体单体(-5)、7q的缺失(7q-)、7号染色体单体(-7)、20q的缺失(20q-)、8号染色体三体(+8)、Y号染色体单体(-Y)为主，不同染色体异常的患者有着不同的临床特征和发病过程，所以染色体的异常与MDS患者的诊断、治疗及预后有很大的相关性。目前，临床上对染色体异常的诊断方法主要是常规细胞遗传学(CC)分析和荧光原位杂交(FISH)分析，虽然常规细胞遗传学分析法(主要为核型分析)比较可靠，也是检测染色体异常的金标准，但是CC需要分离培养细胞，诱导其成为中期细胞才能进行检测，且该分析方法缺乏灵敏度。另外，MDS临床表现是血细胞减少且细胞又比较难于扩增，如果得不到足够数量的中期细胞，CC分析方法则不能得到足够的诊断信息。荧光原位杂交(FISH)技术是利用碱基的互补性，将标记荧光素的探针与待检测的样本DNA进行杂交，通过荧光显微镜收集荧光信号对待测核酸进行定性、定量及相对定位分析。FISH与CC相比其优势是无需分离培养细胞，直接用间期细胞就可以进行检测，且比CC更灵敏。因此，现在FISH越来越多地用于MDS的诊断。定量多基因荧光原位杂交技术(QM-FISH)是指在同一时间内定量单个肿瘤细胞核的多个基因，可用于大规模研究临床肿瘤标本基因拷贝数的变化。然而，目前大多数在临床中使用的FISH试剂盒为单色或双色试剂盒，在MDS染色体异常的检测中需要进行多次(5次以上)检测。但MDS是一种细胞减少的疾病，其骨髓血样往往不够进行多次检测。因此，本项目旨在研发一种高分辨多色FISH诊断试剂盒，可在单个细胞水平同时检测多种染色体的异常，对于MDS这种有多种染色体异常且细胞量减少的疾病的诊断、分型、治疗、预后评估具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物及试剂盒，可以用于确定骨髓增生异常综合症的分子病理类型，判断病情预后，指导个体化治疗，评估临床治疗效果，监测病灶复发和转移。为了解决上述问题，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供了一种检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物，包括20q12探针，5P15.2探针，EGR1探针，CSPY探针，CSP8探针，CSP7探针和D7S486探针。具体地，所述探针组合物包括：优选地，所述20q12探针，5P15.2探针，EGR1探针，CSPY探针，CSP8探针，CSP7探针和D7S486探针均为经过荧光素标记的探针。优选地，所述的探针组合物分为两组：第一组KIT1含4个探针：5P15.2/EGR1/20q12/CSPY；第二组KIT2含3个探针：CSP7/D7S486/CSP8；每组的探针之间采用不同颜色的荧光素标记。根据本专利技术一个优选的实施方案，20q12,5P15.2,EGR1,CSPY,CSP8,CSP7和D7S486单个探针制备步骤如下：1)克隆筛选：检索UCSCgenomebrowser，NCBICloneRegistry，EnsemblGenomeBrowser等数据库分别含20q12,5P15.2,EGR1,CSPY,CSP8,CSP7和D7S486的所有克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最佳的克隆。2)克隆培养：按照筛选确定的克隆编号购买BAC克隆(美国Invitrogen公司)，划线接种到含有氯霉素的琼脂平板上，37℃培养过夜；挑取单克隆到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振摇活化培养8-16小时；然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震摇培养16-24小时。3)探针的制备和鉴定：获得BAC克隆后，提取大量DNA，用ND-1000超微量分光光度计对质粒进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定。酶切DNA后采用缺口平移的方法进行荧光素标记(选择最佳的荧光染料和镜检的荧光显微镜的滤光片匹配组合，使检测到的荧光信号强度最大)，标记好的探针用1-2％的琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析。对选取的20q12,5P15.2,EGR1,CSPY,CSP8,CSP7和D7S486的各个BAC克隆连接好荧光素后进行沉淀和浓缩，溶解到含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液中，用FISH杂交的方法在正常人二倍体成纤维细胞(HDF)爬片上进行杂交，从而完成待选克隆的分子鉴定。根据本专利技术一个优选的实施方案，20q12,5P15.2,EGR1,CSPY,CSP8,CSP7和D7S486探针组合物的制备步骤如下：1)克隆筛选：检索UCSCgenomebrowser，NCBICloneRegistry，EnsemblGenomeBrowser数据库分别含有20q12,5P15.2,EGR1,CSPY,CSP8,CSP7和D7S486的所有细菌人工染色体(BAC)克隆，根据单个探针连接后产物琼脂糖凝胶电泳和FISH鉴定的结果，选出每种探针中最佳的克隆。2)克隆培养：将筛选确定的BAC克隆划线接种到含有氯霉素的琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振摇活化培养8-16小时。然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震摇培养16-24小时。3)探针的制备和验证：获得每组目的染色体和基因的克隆后，提取大量DNA，用ND-1000超微量分光光度计对质粒进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定。酶切DNA后采用缺口平移的方法进行荧光素标记(选择最佳的荧光染料和镜检的荧光显微镜的滤光片匹配组合，使检测到的荧光信号强度最大)。将连接好荧光素的探针分为两组：第一组：KIT1：20q12-B,5P15.2-G,EGR1-O,CSPY-R；第二组：KIT2：CSP8-B,CSP7-G和D7S486-O进行沉淀和浓缩，溶解到含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液中，即得两组的荧光标记探针杂交混合液，用FISH杂交的方法在正常人二倍体成纤维细胞(HDF)爬片上进行杂交，从而完成两组探针的FISH验证。根据本专利技术一个优越的实施方案，克隆筛选步骤中含20q12基因最优的克隆，为如下编号的一种、两种或三种组合：20q12-R1：RP11-879B22；20q12-R2：CTD-2504C8；20q12-R3：RP11-773O18；含5P15.2最优的克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物，其特征在于：包括20q12探针，5P15.2探针，EGR1探针，CSPY探针，CSP8探针，CSP7探针和D7S486探针。

【技术特征摘要】
1.一种检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物，其特征在于：包括20q12探针，5P15.2探针，EGR1探针，CSPY探针，CSP8探针，CSP7探针和D7S486探针。2.根据权利要求1所述的一种检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物，其特征在于：所述20q12探针，5P15.2探针，EGR1探针，CSPY探针，CSP8探针，CSP7探针和D7S486探针均为经过荧光素标记的探针。3.根据权利要求1或2所述的一种检测骨髓增生异常综合症的染色体和基因探针组合物，所述的探针组合物分为两组：第一组KIT1含4个探针：5P15.2/EGR1/20q12/CSPY；第二组KIT2含3个探针：CSP7/D7S486/CSP8；每组的探针之间采用不同颜色的荧光素标记。4.权利要求1-3任一项所述的探针组合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：1)克隆选择：选择含20q12基因克隆，为如下编号的一种、两种或三种组合：20q12-R1：RP11-879B22；20q12-R2：CTD-2504C8；20q12-R3：RP11-773O18；含5P15.2克隆，为如下编号的一种或两种组合：5P15.2-R1：RP11-1047J7；5P15.2-R2：RP11-1021K13；含有EGR1克隆，为如下编号的一种或两种组合：EGR1-R1：RP11-461O14，EGR1-R2：CTD-2108N19；含有CSPY克隆，为如下编号的一种或两种组合：CSPY-R11：RP11-960M2，CSPY-R14：CTD-2657K20；含有CSP8克隆，为如下编号的一种、两种或三种组合：CSP8-R1：RP11-747K13；CSP8-R2：RP11-31I4；CSP8-R3：RP11-112B4；含有CSP7克隆，为如下编号的一种或两种组合：CSP7-R4：RP11-1054N15；CSP7-R5：RP11-357N20；含有D7S486克隆，为如下编号的一种或两种组合：D7S486-R1：RP11-258A7；D7S486-R2：RP11-51M22；以上克隆均来自UCSCgenomebrowser数据库；2)克隆培养：将筛选确定的BAC克隆划线接种到含有氯霉素的琼脂平板上，37℃培养过夜；挑取单克隆到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振摇活化培养8-16小时；然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震摇培养16-24小时；3)探针的制备和验证：获得每组目的染色体和基因的克隆后，提取大量DNA，用ND-1000超微量分光光度计对质粒进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定；酶切DNA后采用缺口平移的方法进行荧光素标记；将连接好荧光素的探针分为两...

【专利技术属性】
技术研发人员：程涛，缪为民，胡林萍，孙江漫，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12