用荧光RT‑PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种用荧光RT‑PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物及其用途，包括一对适用于实时荧光PCR检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物对，上游引物：FABP2‑F：5'‑CTTCCTCTTGCTTCTTACCTGC‑3'，下游引物：FABP2‑R：5'‑ATGTGGCAATCACCGTCTGT‑3'；还包括一对用于实时荧光PCR内对照的引物对，上游引物：C‑β‑actin‑F：5'‑CTATGTCGCCTTGGACTTCG‑3'，下游引物：C‑β‑actin‑R：5'‑TGTTGTAGGTGGTCTCGTGGA‑3'。本发明专利技术当FABP2基因相对表达量增高时，半滑舌鳎可能处于病原感染状态，通过监测半滑舌鳎肠道组织FABP2基因表达量的变化，可提早判断半滑舌鳎是否感染病原引起肠道炎症，并根据判断采取预防治疗措施，避免病势严重发展造成不可挽回的损失。

Using fluorescent RT detection technology PCR Cynoglossus semilaevis FABP2 gene specific primers and its use

【技术实现步骤摘要】
用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物及其用途
本专利技术涉及生物
，具体说，是一种用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物及其用途。
技术介绍
水产养殖的发展面临着许多困难，但种质和种苗、养殖环境和病害是三大主要问题，其中病害对水产养殖业发展的阻碍日益严重。伴随鱼类养殖业的快速发展，养殖密度和集约化程度的不断提高，养殖病害已成为限制鱼类养殖业可持续健康发展难以逾越的瓶颈，各种传染性疾病给水产养殖业带来了灾难性甚至是毁灭性的打击。病害的防治和控制已经成为发展水产养殖业应该解决的首要问题。许多传染性的鱼病，在其发病过程中都可能出现肠道充血、发炎等炎性症状，但由肠道致病菌引起的细菌性肠炎病发生更为普遍，我国各养殖地区的海水及淡水鱼均有发生。但目前对鱼类肠炎病或有并发肠炎疾病的诊断基本上是解剖之后基于肠道病症以及组织病理学特征。半滑舌鳎(CynoglossussemilaevisGünther)是一种广泛分布于我国沿海地区的底栖鱼类，尤其在黄海和渤海分布较多。半滑舌鳎出肉率高，营养丰富，味道鲜美，具有较高的经济价值。随着半滑舌鳎人工繁殖及养殖技术的日渐成熟，近年来逐渐成为我国最具吸引力的海水养殖鱼类之一。由于目前半滑舌鳎的养殖模式大多为室内工厂化养殖，养殖密度大，而造成疾病频繁发生。半滑舌鳎常见病原菌为副溶血弧菌、鳗弧菌、鳗利斯顿氏菌、发光杆菌、海藻希瓦氏菌等。近年来，天津市养殖半滑舌鳎出现了大量死亡的现象，病鱼往往腹部隆起，严重时整个腹腔由于大量积水而呈半透明状，部分消化道从泄殖孔中凸出，打开腹腔后，发现病鱼胃肠道中或腹腔内有大量无色或淡黄色的液体，解剖后可见明显肠炎症状，临床上一般称其为“腹水病”。肠型脂肪酸结合蛋白(FABP2)是脂肪酸结合蛋白超家族中的重要成员，主要参与机体对脂肪酸的吸收、转运、以及在细胞器内的再分布及利用。近年研究表明，FABP2与代谢性疾病、炎症性疾病、肠组织缺血损伤等密切相关，不但是肠组织损伤的敏感性标志，而且可以作为炎症严重程度的评价指标。实时荧光PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。近年来出现的实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。一方面实时荧光PCR技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝数成为可能。另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展，使定量PCR技术有一个足够的基础为广大临床诊断实验室所接受，这将有助于对疾病的诊断和治疗。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，近年来，实时荧光PCR技术在动物疫病诊断中也得到了广泛的应用。肠型脂肪酸结合蛋白(FABP2)是脂肪酸结合蛋白超家族中的重要成员，主要参与机体对脂肪酸的吸收、转运、以及在细胞器内的再分布及利用。近年研究表明，FABP2与代谢性疾病、炎症性疾病、肠组织缺血损伤等密切相关，不但是肠组织损伤的敏感性标志，而且可以作为炎症严重程度的评价指标。FABP2于肠道粘膜上皮细胞的表达情况，能提示炎症严重程度及愈后情况。FABP2能够提示肠道功能失调以及肠道的吸收障碍。研究证明，FABP2在肠道炎症中有明显的提高,推测可作为预测炎症严重程度的一个指标。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物及其用途，具有灵敏度高，特异性好的特点。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物，包括一对适用于实时荧光PCR检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物对，其核苷酸序列如下：上游引物：FABP2-F：5'-CTTCCTCTTGCTTCTTACCTGC-3'SEQIDNO.1下游引物：FABP2-R：5'-ATGTGGCAATCACCGTCTGT-3'SEQIDNO.2。还包括一对用于实时荧光PCR内对照的引物对，其核苷酸序列如下：上游引物：C-β-actin-F：5'-CTATGTCGCCTTGGACTTCG-3'SEQIDNO.3下游引物：C-β-actin-R：5'-TGTTGTAGGTGGTCTCGTGGA-3'SEQIDNO.4。上述用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物用于检测半滑舌鳎肠道炎症的用途。本专利技术的有益效果是：当FABP2基因相对表达量增高时，半滑舌鳎可能处于病原感染状态，但此时还不能从临床症状观察到半滑舌鳎有任何感染症状。因此通过监测半滑舌鳎肠道组织FABP2基因表达量的变化，可提早判断半滑舌鳎是否感染病原引起肠道炎症，并根据判断采取预防治疗措施，避免病势严重发展造成不可挽回的损失。附图说明图1是利用引物FABP2-F和FABP2-R扩增FABP2基因的PCR产物的电泳图。图2是利用引物C-β-actin-F和C-β-actin-R扩增β-actin基因的PCR产物的电泳图。图3是健康和感染半滑舌鳎FABP2基因相对于β-actin基因的表达量图。图4是感染半滑舌鳎FABP2基因相对于健康半滑舌鳎FABP2基因的表达量图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明：1.引物设计：根据FABP2基因的全长序列，使用primer6软件设计适用于实时荧光PCR检测的特异性引物，引物序列如下：上游引物：FABP2-F：5'-CTTCCTCTTGCTTCTTACCTGC-3'SEQIDNO.1下游引物：FABP2-R：5'-ATGTGGCAATCACCGTCTGT-3'SEQIDNO.2FABP2基因的PCR产物预计长度为107bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物特异性强，适合用于实时荧光PCR检测。琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。同时，根据NCBI里提供的半滑舌鳎β-actin基因的cds的序列(KP033459)设计用于实时荧光PCR内对照的引物，引物序列如下：上游引物：C-β-actin-F：5'-CTATGTCGCCTTGGACTTCG-3'SEQIDNO.3下游引物：C-β-actin-R：5'-TGTTGTAGGTGGTCTCGTGGA-3'SEQIDNO.4半滑舌鳎β-actin基因的PCR产物预计长度为191bp。琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光PCR检测时作为内对照扩增。琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。本专利技术所述的每条引物分别配制成浓度为25μl/L的贮存液，工作浓度为0.5μl/L。2.半滑舌鳎感染试验：未使用过疫苗的健康半滑舌鳎(19±0.5cm；130±5g)18尾，暂养于水族箱内，每尾腹腔注射海藻希瓦氏菌活菌0.2mL或者注射0.2mLPBS用作对照，继续养殖，于0h和12h处死半滑舌鳎解剖并分离肠道组织。3.总RNA提取与纯化：采用各种通用的提取方法和纯化方法，从半滑舌鳎肠道中提取得到纯化的半滑舌鳎肠道组织总RNA。4.cDNA第一链合成：cDNA第一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用荧光RT‑PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物，其特征在于，包括一对适用于实时荧光PCR检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物对，其核苷酸序列如下：上游引物：FABP2‑F：5'‑CTTCCTCTTGCTTCTTACCTGC‑3'SEQ ID NO.1下游引物：FABP2‑R：5'‑ATGTGGCAATCACCGTCTGT‑3'SEQ ID NO.2。

【技术特征摘要】
1.一种用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物，其特征在于，包括一对适用于实时荧光PCR检测半滑舌鳎FABP2基因的特异性引物对，其核苷酸序列如下：上游引物：FABP2-F：5'-CTTCCTCTTGCTTCTTACCTGC-3'SEQIDNO.1下游引物：FABP2-R：5'-ATGTGGCAATCACCGTCTGT-3'SEQIDNO.2。2.根据权利要求1所述用荧光RT-PCR技术检测半滑舌鳎F...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙敬锋，韩卓然，吕爱军，胡秀彩，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：天津,12