用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对。所述引物对包括针对CYP3A4*1G基因位点的特异性引物及探针。本发明专利技术涉及一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的试剂盒。所述试剂盒包括含有上述引物及探针的PCR反应液、PCRbuffer、dNTP、无核酸酶水及HS Taq酶。本发明专利技术还涉及一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的方法。本发明专利技术提供的试剂盒及其检测方法具有操作简单、检测快速、准确性高、特异性好、灵敏性好、使用方便并能有效满足临床要求的优点。

Primer pairs, kit and methods used to guide the detection of related genes for the individualized drug use of fentanyl drugs

The present invention relates to a primer pair used to guide the detection of related genes for the individualized drug use of the fentanyl. The primers are specific primers and probes for the CYP3A4*1G gene loci. The present invention relates to a kit used to guide the detection of related genes for the individualized drug use of fentanyl. The kit containing the primer and probe of PCR, dNTP, PCRbuffer reaction liquid, nuclease free water and HS Taq enzyme. The invention also relates to a method used to guide the detection of related genes for the individualized drug use of fentanyl. The kit and the detection method provided by the invention have the advantages of simple operation, fast detection, high accuracy, good specificity, good sensitivity, convenient operation, and can effectively meet the clinical requirements.

【技术实现步骤摘要】
用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对、试剂盒及方法
本专利技术涉及体外诊断
，特别的，涉及一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对、试剂盒及方法。
技术介绍
CYP3A家族是人体内介导最多数量药物代谢的药物代谢酶，在体内占CYP450总量的70％，占肝内CYP450的30％，参与60％以上常用药物在体内的代谢转化。目前，在人体内己发现4种CYP3A～基因，即CYP3A4、CYF3A5、CYP3A7和CYP3A43，而其中CYP3A4是临床上最重要的P450酶之一，参与代谢38个类别的150多种药物的氧化代谢，约占全部药物的50％，是许多药物因相互作用发生不良反应的根源。CYP3A4在肝脏中含量及其酶活性存在明显的个体差异，肝微粒体中可相差40倍，在体内则有5倍的个体间差异，遗传因素是造成这种差异的主要原因，即编码CYP3A4酶的基因存在多态性。多数CYP3A4的单核苷酸多态性可以影响基因的后续转录和表达，进而改变了酶的结构和活性，这是造成个体差异的主要原因。编码CYP3A4蛋白的基因位于染色体7q21.3-22.1，编码区域包含13个外显子和12个内含子，主要调控其转录及表达的结构区位于5端，长约27kb，CYP3A4基因多态性具体详见CYP等位基因数据库(http://www.cypalleles.ki.se)。迄今为止，CYP3A4有40个等位基因及单体型已经确定，不同种族间CYP3A4SNPs的发生频率不同，如CYP3A4*3和*17仅在白种人中发现，CYP3A4*15只在黑种人中发现，而CYP3A4*16仅存在于日本人和墨西哥人中，在已发现的SNPs中，CYP3A4*4，*5，*6，*18，*19在中国人中已确定，它们的发生频率分别为1.5％，0.98％，0.5％，2％和2％，突变频率较低。2004年日本人通过大规模测序方法，在内含子10上发现了CYP3A4*1G(20230G>A)。CYP3A4*1G是目前已发现的中国人所有的CYP3A4单核苷酸多态性中发生频率最高的一个位点，约为20-30％。2006年，DuJ等在60名健康中国人发现CYP3A4*1G等位基因频率为37％，后来又筛查了264名侗族、488名汉族和230名畲族人群，发现CYP3A4*1G等位基因频率分别为29％、22.1％和31.2％。临床发现应用相同剂量芬太尼后其镇痛效果及不良反应存在明显的个体差异，研究认为静脉注射芬太尼后体内药动学个体差异导致血药浓度的个体差异是产生这种现象的重要原因。研究表明，芬太尼类药物在肝脏内主要通过CYP3A4酶代谢。其基因多态性对酶活性的影响可导致此类药物在体内的代谢及术后药物需求量的改变。Zhang等人的研究中在194例拟行上腹部手术的妇科患者中进行CYP3A4*1G突变基因分型，采用芬太尼术后自控镇痛，同时进行测定CYP3A4酶活性，研究发现，CYP3A4*1G突变与芬太尼术后静脉镇痛效应有关，可降低术后芬太尼消耗量。张豪勇等人研究中发现在健康成年女性中，静脉应用芬太尼后CYP3A4*1G/*1G组终末消除半衰期tl/2β较突变杂合子组和野生纯合子组长，AUC0～∞也较突变杂合子组和野生纯合子组高。因此，进行CYP3A4*1G基因分型检测，可以为临床芬太尼类镇痛药的个体化用药提供参考。由于每个人的遗传因素不同，同一种药物，对于不同的个体其疗效和副作用就会存在着明显的个体差异，因此临床上在对病人进行药物治疗时需首先进行相关药物代谢酶和受体基因型的检测，然后选择合适的药物进行治疗，它可以根据病人的基因信息为其提供“定制医疗”服务，使治疗更加具体而精准。目前常采用的基因多态性检测技术主要包括测序法和荧光法。测序法存在操作繁琐、耗时长、灵敏度低等缺点，限制了其在临床实验室的快速准确筛查。因此，我们根据目前临床芬太尼类药物治疗的现状，选择了与常用芬太尼类药物的药代动力学过程和药效学过程密切相关的CYP3A4*1G基因多态性，开发一种具有完善质控，检测快速、准确的用于CYP3A4*1G基因多态性检测的试剂盒。此外，本专利技术采用TAQMAN等位基因技术与荧光PCR技术相结合的检测试剂盒，适用于临床推广和产业化。
技术实现思路
为了解决传统临床经验医疗方式诊断及芬太尼类药物用药时易出现临床用药不良反应且没有合适的试剂盒产品的技术问题，本专利技术提供一种操作简单、检测快速、准确性高及特异性好的用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对、试剂盒及其方法。本专利技术提供了一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对，包括针对CYP3A4*1G基因位点的特异性引物及探针，如下：CYP3A4*1G正向引物：5'-AGGAGGCATTTTTGCTAAGGTTTC-3'(SEQIDNO.1)；CYP3A4*1G反向引物：5'-CAGGAGGAAATTGATGCAGTTTT-3'(SEQIDNO.2)；CYP3A4*1G突变型探针：5'FAM-CATGTATCATCCACTCAC-MGB3'(SEQIDNO.3)；CYP3A4*1G野生型探针：5'VIC-ATGTACCATCCACTCAC-MGB3'(SEQIDNO.4)。本专利技术还提供了一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液为CYP3A4*1GPCR反应液，其包括：CYP3A4*1G正向引物、CYP3A4*1G反向引物、CYP3A4*1G突变型探针及CYP3A4*1G野生型探针；上述PCR反应液还包括PCRbuffer，dNTP、HSTaq酶及无核酸酶水。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述PCR反应液的成分终浓度为：1×PCRbuffer，0.2μM的各特异性引物及探针、0.25mM的dNTP、1U的HSTaq酶。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，还包括阳性对照品一、阳性对照品二及阳性对照品三；所述阳性对照品一为CYP3A4*1G基因位点野生型质粒；所述阳性对照品二为CYP3A4*1G基因位点野生型与突变型按1：1数量比杂合的质粒；所述阳性对照品三为CYP3A4*1G基因位点突变型质粒。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，还包括空白对照品，所述空白对照品为无核酸酶水。本专利技术还提供了一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的方法，包括如下步骤：步骤一：取待检测样本抽提的DNA，作为PCR模板；步骤二：提供如权利要求5所述的试剂盒，取出适量PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述PCR模板混匀；步骤三：进行PCR扩增反应：95℃变性5min；40cycles，95℃15sec，60℃30sec，采集荧光；步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的阳性对照品和空白对照品符合规定的情况下，根据荧光扩增曲线得到CT值进行结果判定，得到用于芬太尼类药物个体化用药相关基因的基因型。相较于现有技术，本专利技术提供的用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对、试剂盒及方法的有益效果在于：通过设计特异性高的引物及TAQMAN-MGB荧光检测探针并通过检测荧光的释放和强度来检测基因多态性，此外再配置成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对，其特征在于，包括针对CYP3A4*1G基因位点的特异性引物及探针，如下：CYP3A4*1G正向引物：5'‑AGGAGGCATTTTTGCTAAGGTTTC‑3'；CYP3A4*1G反向引物：5'‑CAGGAGGAAATTGATGCAGTTTT‑3'；CYP3A4*1G突变型探针：5'FAM‑CATGTATCATCCACTCAC‑MGB 3'；CYP3A4*1G野生型探针：5'VIC‑ATGTACCATCCACTCAC‑MGB 3'。

【技术特征摘要】
1.一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的引物对，其特征在于，包括针对CYP3A4*1G基因位点的特异性引物及探针，如下：CYP3A4*1G正向引物：5'-AGGAGGCATTTTTGCTAAGGTTTC-3'；CYP3A4*1G反向引物：5'-CAGGAGGAAATTGATGCAGTTTT-3'；CYP3A4*1G突变型探针：5'FAM-CATGTATCATCCACTCAC-MGB3'；CYP3A4*1G野生型探针：5'VIC-ATGTACCATCCACTCAC-MGB3'。2.一种用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液为CYP3A4*1GPCR反应液，其包括：CYP3A4*1G正向引物、CYP3A4*1G反向引物、CYP3A4*1G突变型探针及CYP3A4*1G野生型探针；上述PCR反应液还包括PCRbuffer，dNTP、HSTaq酶及无核酸酶水。3.根据权利要求2所述的用于指导芬太尼类药物个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液的成分终浓度为：1×PCRbuffer，0.2μM的各特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩林志，肖芳，邓思铭，
申请(专利权)人：韩林志，
类型：发明
国别省市：湖南,43