用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的引物对、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的引物对。所述引物对包括Septin9正向引物、反向引物及检测探针，β‑Actin正向引物、反向引物及检测探针。本发明专利技术涉及一种用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的试剂盒。所述试剂盒包括含有上述引物及探针的PCR反应液，其包括正向引物、反向引物、检测探针，10×PCR buffer，dNTP、无核酸酶水及Ex Taq酶。本发明专利技术还涉及一种用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的方法。本发明专利技术提供的试剂盒及其检测方法具有检测结果准确、检测通量高、特异性好、灵敏性好、检测时间快速、使用方便并能有效满足临床要求的优点。

Primer pairs, kit and method for detection of colorectal cancer related gene Septin9 methylation

The invention relates to a primer pair for detecting methylation of Septin9 genes related to colorectal cancer. The primer pairs include Septin9 forward primers, reverse primers and detection probes, beta Actin forward primers, reverse primers and detection probes. The invention relates to a kit for detecting Septin9 methylation of colorectal cancer related genes. The kit includes the PCR reaction liquid containing the primers and probes, including positive primers, reverse primers, detection probes, 10 x PCR buffer, dNTP, no nuclease water and Ex Taq enzyme. The invention also relates to a methylation detection method for colorectal cancer related genes Septin9. The kit provided by the invention has the advantages of accurate detection results, high detection flux, good specificity, good sensitivity, fast detection time, convenient use and effective meeting the clinical requirements.

【技术实现步骤摘要】
用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的引物对、试剂盒及方法
本专利技术涉及体外诊断
，特别的，涉及一种用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的引物对、试剂盒及方法。
技术介绍
Septin9基因是近年来发现的一种潜在的抑癌基因，位于人类染色体2q23上，是调控细胞正常生长的基因之一。其编码的蛋白位于胞质，是一种高度糖基化的蛋白，是p53介导的细胞周期调控的下游信号，可使异常的细胞停滞在G2期，阻止细胞增殖。Septin9启动子异常甲基化可以抑制转录，引起G2/M检查点调控发生紊乱，导致细胞异常增殖。Septin9基因甲基化及其表达的缺失与多种癌症或肿瘤细胞株相关，其中包括结直肠癌、胆囊癌、淋巴瘤、大肠癌、食管腺癌、乳腺癌及白血病，其中Septin9基因启动子甲基化在结直肠癌患者中占比率大于70％。此外，结直肠癌患者血浆中发现的APC，SHP1，E-cadherin，ER，Septin9，SEMA3B，and3OST2等7种高频率甲基化的基因中，只有Septin9基因在非结直肠癌患者的血浆中是呈显著性低频率甲基化，这说明Septin9可以做为结直肠癌早期的肿瘤标志物。另一方面，增强Septin9mRNA及蛋白的表达通过使用去甲基化制剂可使抑癌基因重获作用，其干扰下可能减少Septin9异常甲基化的发生，并且联合应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂后，抑制肿瘤细胞生长的效果更显著，这为肿瘤的治疗提供了实验依据，对肿瘤患者预后有重要意义。结直肠癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，发病率仅次于肺癌和乳腺癌，位居恶性肿瘤第3位。WHO统计数据表明，结直肠癌患者的5年生存率在北美国家达61％，而我国仅有32％。研究认为，5年生存率与诊断时疾病的严重程度具有明显的相关性，进展期患者的5年生存率不到10％，而早期诊断的结直肠癌患者的5年生存率则可达92％。从2008年到2013年间,结直肠癌发病率和死亡率呈逐年上升趋势。值得关注的是，近年来在全球范围内结直肠癌的发病人群有年轻化的趋势，而中国的青年人(<30岁)结直肠癌的发生率高达15％，从而极大地危害了我国人们的生命安全和身体健康。因此，早发现、早诊断、早治疗对于提高结直肠癌治疗效果具有重大意义。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，S-腺苷甲硫氨酸的甲基(-CH3)共价结合到DNA分子的胞嘧啶(C)碱基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5mC)，而并不改变DNA的序列。众多研究表明，SEPT9基因启动子甲基化与结直肠癌的发生和发展密切相关，它是结直肠癌特异的分子标记。因此，检测结直肠癌SEPT9基因启动子的甲基化状态，对结直肠癌的诊断、治疗、预后判断等方面具有重要意义。目前，传统的甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR及亚硫酸氢盐测序法。然而这些方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的缺点，限制了其在临床实验室的广泛应用。本专利技术采用荧光实时PCR技术，对病人血浆游离核酸Septin9基因甲基化进行检测，通过对样本进行重亚硫酸盐处理后，通过特异性引物和探针对核酸进行扩增，以达到快速检测Septin9基因甲基化的目的，最终间接为人结直肠癌早期诊断提供有效信息，为人结直肠癌早发现早治疗提供一种简便易行的方法。
技术实现思路
为了解决上述传统甲基化检测方法存在操作繁琐、准确性低及敏感性不高的技术问题，本专利技术提供一种操作简单、准确性高及敏感性高且基于荧光PCR技术的用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的引物对、试剂盒及其方法。本专利技术提供了一种用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的引物对，包括针对Septin9基因的启动子区和β-Actin内参基因的特异性引物及探针，如下：Septin9正向引物：5'-AAATAATCCCATCCAACTA-3'(SEQIDNO.1)，Septin9反向引物：5'-GATTYGTTGTTTATTAGTTATTATGT-3'(SEQIDNO.2)，Septin9检测探针：5'FAM-TTAACCGCGAAATCCGAC-3'MGB(SEQIDNO.3)；β-Actin正向引物：5'-GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3'(SEQIDNO.4)，β-Actin反向引物：5'-CCAAACTATAACCTCTACAACCTTCAAAA-3'(SEQIDNO.5)，β-Actin检测探针：5'VIC-CCCATTAACTAAACACAACCT-3'MGB(SEQIDNO.6)。其中，Y为兼并碱基，即Y＝C/T。本专利技术还提供了一种用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的试剂盒，包括含有如上述引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液包括：Septin9正向引物、Septin9反向引物、Septin9检测探针，β-Actin正向引物、β-Actin反向引物、β-Actin检测探针，10×PCRbuffer，dNTP及无核酸酶水。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括ExTaq酶。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述PCR反应液的成分终浓度为：1×PCRbuffer，0.4μMSeptin9正向引物、0.4μMSeptin9反向引物、0.4μMSeptin9检测探针，0.4μMβ-Actin正向引物、0.4μMβ-Actin反向引物、0.4μMβ-Actin检测探针，0.25mMdNTP。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括阳性对照品及阴性对照品，所述阳性对照品为Septin9甲基化标准品DNA，所述阴性对照品为非甲基化标准品DNA。其中所述甲基化标准品DNA为正常人外周血基因组DNA经SssⅠ甲基化酶处理，可使基因组所有CG序列中的C在C5位置上甲基化；所述非甲基化标准品DNA为正常人外周血基因组DNA。本专利技术还提供了一种用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的方法，包括如下步骤：步骤一：取待检测样本抽提的DNA，对其进行转化处理，转化后的DNA作为PCR的模板；步骤二：提供上述用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的试剂盒，对所述模板进行PCR扩增；步骤三：根据Septin9与β-Actin基因PCR扩增结果的相对荧光CT值来确定待检测样本的甲基化率，即待检测样本中Septin9/β-Actin的比值除以阳性对照品中Septin9/β-Actin的比值。在本专利技术提供的所述方法的一种较佳实施例中，所述步骤一中转化处理所采用的试剂为亚硫酸氢盐或重亚硫酸盐。在本专利技术提供的所述方法的一种较佳实施例中，所述步骤二中PCR扩增反应程序为：95℃变性10min；50cycles，95℃15sec，60℃30sec。相较于现有技术，本专利技术提供的用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的引物对、试剂盒及方法的有益效果在于：一、通过设计特异性高的引物及探针，并配置成使用方便且检测结果可靠的试剂盒，再设计出科学合理的PCR反应体系，使得本专利技术具有快速、高通量、灵敏及特异性好的特点，实现对结直肠癌Septin9基因的甲基化程度快速及准确测量，以便对结直肠癌间接进行及时、有效的诊断和治疗，降低医疗成本，节约社会资源。二、使用基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的引物对，其特征在于，包括针对Septin9基因的启动子区和β‑Actin内参基因的特异性引物及探针，如下：Septin9正向引物：5'‑AAATAATCCCATCCAACTA‑3'，Septin9反向引物：5'‑GATTYGTTGTTTATTAGTTATTATGT‑3'，Septin9检测探针：5'FAM‑TTAACCGCGAAATCCGAC‑3'MGB；β‑Actin正向引物：5'‑GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT‑3'，β‑Actin反向引物：5'‑CCAAACTATAACCTCTACAACCTTCAAAA‑3'，β‑Actin检测探针：5'VIC‑CCCATTAACTAAACACAACCT‑3'MGB。

【技术特征摘要】
1.一种用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的引物对，其特征在于，包括针对Septin9基因的启动子区和β-Actin内参基因的特异性引物及探针，如下：Septin9正向引物：5'-AAATAATCCCATCCAACTA-3'，Septin9反向引物：5'-GATTYGTTGTTTATTAGTTATTATGT-3'，Septin9检测探针：5'FAM-TTAACCGCGAAATCCGAC-3'MGB；β-Actin正向引物：5'-GGTTAGGAAGGAGGTTGTTTGTTTT-3'，β-Actin反向引物：5'-CCAAACTATAACCTCTACAACCTTCAAAA-3'，β-Actin检测探针：5'VIC-CCCATTAACTAAACACAACCT-3'MGB。2.一种用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的PCR反应液，所述PCR反应液包括：Septin9正向引物、Septin9反向引物、Septin9检测探针，β-Actin正向引物、β-Actin反向引物、β-Actin检测探针，10×PCRbuffer，dNTP及无核酸酶水。3.根据权利要求2所述的用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ExTaq酶。4.根据权利要求2所述的用于结直肠癌相关基因Septin9甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液的成...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩林志，肖芳，李书，
申请(专利权)人：韩林志，
类型：发明
国别省市：湖南,43