用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的引物组。所述引物组包括针对GPIa(807C>T)、GPIa(873G>A)及COX1(‑1676A>G)三个基因位点多态性检测的特异性引物及探针。本发明专利技术还涉及一种用于指导阿司匹林个体化用药相关基因多态性检测的试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括含有上述引物及探针的PCR反应液、PCR buffer、dNTPS、无核酸酶水及HS‑Taq酶。本发明专利技术提供的试剂盒及其检测方法具有操作简单、检测快速、准确性高、特异性好、灵敏度高、使用方便并能有效满足临床要求的优点。

Primer set, reagent kit and method for guiding individual gene testing of aspirin individualization

The invention relates to a primer set for guiding the individual drug related gene detection of aspirin. The primers for GPIa group (807C> T), GPIa (873G> A) and COX1 (1676A> G) three gene polymorphism detection of specific primer and probe. The invention also relates to a kit and a detection method for guiding the individual polymorphism of aspirin related genes. The kit containing the primer and probe of PCR reaction solution, PCR buffer, dNTPS, and HS nuclease free water enzyme Taq. The kit and the detection method provided by the invention have the advantages of simple operation, fast detection, high accuracy, good specificity, high sensitivity, convenient use, and effectively meeting the clinical requirements.

【技术实现步骤摘要】
用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的引物组、试剂盒及方法
本专利技术涉及体外诊断
，特别的，涉及一种用于指导阿司匹林个体化用药相关基因多态性检测的引物组、试剂盒及方法。
技术介绍
阿司匹林作为一种有效的抗血小板聚集药，可抑制血小板活化、聚集，防止血栓形成，在心脑血管病的一、二级防治中，起着至关重要的作用。然而，临床发现部分长期服用阿司匹林的患者，心脑血管事件的发生率并未降低，即可能在一定程度上存在阿司匹林抵抗(Aspirinresistance，AR)现象。有研究报道5％-40％的人存在阿司匹林抵抗。阿司匹林(aspirin)可与COX活性部分丝氨酸残基发生不可逆的乙酰化反应，使COX失活，抑制血小板功能。COX-1启动子区的SNPCOX1(-1676A>G)位点多态性会影响COX-1的表达，使阿司匹林可能对血小板COX不能完全抑制，从而存在一定程度的阿司匹林抵抗。在一项对老年心脑血管病患者发生阿司匹林抵抗的研究中，研究者首次发现COX-1基因-1676A>G位点(rs1330344)的多态性可能与中国汉族人群AR的发病相关。血小板表面主要有GPⅠa/Ⅱa、GPⅥ、GPⅣ三种胶原受体。GPⅠa/Ⅱa位于连接血小板与胶原纤维(Ⅰ、Ⅱ型)或非胶原纤维(Ⅲ、Ⅳ型)的二价阳离子键之间。GPIa基因位于第5号染色体上，它的SNP常常会改变血小板膜胶原受体的密度，使血小板的聚集、血栓形成发生改变，影响阿司匹林的疗效。807C>T和873G>A已被证实与血小板表面受体不同的表达有关。基因型807TT(873AA)与受体的高密度表达有关，而807CC(873GG)则与低密度表达有关，杂合子则与中间受体表达的水平有关。Santoso等研究发现携带rs1126643T等位基因，血小板表面的GPⅠa/Ⅱa的密度增加4倍，血小板活性显著增加，血小板聚集加强。苏冠华等对200例服用阿司匹林进行心脑血管病预防的中国汉族高危人群进行分析，结果显示AR和ASR组T等位基因频率均显著高于AS组(χ2＝12.848，P<0.005)；AR组与ASR组的TC和TT基因型频率也均高于AS组(P<0.05)。Logistic回归分析提示，血小板膜蛋白rs1126643T等位基因与AR的发生显著相关(OR3.76，95％CI：2.87～9.58，P<0.05)。因此临床上在对病人进行药物治疗时需首先对与阿司匹林个体化用药相关的基因位点基因进行检测，再判断是否服用阿司匹林进行进行治疗，使治疗更加具体而精准，也可避免延误患者的治疗，减少资源浪费。目前常用的检测基因多态性的方法有DNA直接测序法、限制性片段长度多态性分析法(PCR－PFLP)、高分辨率溶解曲线(HRM)、基因芯片、液相芯片法、荧光定量PCR法等。测序技术是公认的检测基因突变的金标准，但其设备成本高、检测周期长、检测通量低、检测灵敏度低、对实验人员的技术操作要求高、结果判定步骤繁琐等原因，较难形成商业化的诊断产品；限制性片段长度多态性分析法检测灵敏度同样不高、操作步骤繁琐，检测的结果仍需要进行一代测序法的再次验证，尤其当样本量多时极易造成PCR产物的交叉污染容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性结果，因此也无法应用到临床上。芯片检测因其检测结果的准确性和重复性较差，实验周期长等缺点，也不适于开发临床检测试剂盒。荧光定量PCR的检测方法拥有成本低、灵敏度高、特异性好，结果的重复性好等优点。
技术实现思路
为了解决存在阿司匹林抵抗的患者不建议采用阿司匹林药物进行心脑血管病治疗的技术问题，本专利技术从基因层面出发，提供一种指导阿司匹林个体化用药关基因多态性检测的引物组、试剂盒及其方法，具有检测快速、准确性高、灵敏度高及特异性好的优点。本专利技术提供一种用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的引物组，其特征在于，包括针对GPIa(807C>T)、GPIa(873G>A)及COX1(-1676A>G)基因多态性检测的特异性引物及探针，如下：GPIa(807C>T)正向引物：5’-CAACATCCCAGACATCCCAAT-3’；GPIa(807C>T)反向引物：5’-CCTATTAGCACCAAAACTTACCTTGC-3’；GPIa(873G>A)正向引物：5’-CATGTGATTCACCGTCAGTTACAA-3’；GPIa(873G>A)反向引物：5’-TATCTGCCACAGAAAATATGCTTATTC-3’；COX1(-1676A>G)正向引物：5’-CACCCATCTGCACTCAAAACA-3’；COX1(-1676A>G)反向引物：5’-TCTGATTCTGAGGTGAAGGCTCTT-3’；GPIa(807C>T)野生型探针：5’VIC-TCACAAACACATTTGGA-MGB3’；GPIa(807C>T)突变型探针：5’FAM-CAAACACATTCGGAGCA-MGB3’；GPIa(873G>A)野生型探针：5’VIC-TACCATTACTTTCGTAGCAC-MGB3’；GPIa(873G>A)突变型探针：5’FAM-CATTACTTTTGTAGCACTT-MGB3’；COX1(-1676A>G)野生型探针：5’FAM-CCTGGCACTAATG-MGB3’；COX1(-1676A>G)突变型探针：5’VIC-CCTGGCACTGATGG-MGB3’。在本专利技术提供的所述试剂盒一较佳实施例中，包括含有上文所述的特异性引物及探针的三种PCR反应液，所述PCR反应液分别为GPIa(807C>T)PCR反应液、GPIa(873G>A)PCR反应液及COX1(-1676A>G)PCR反应液，其中，GPIa(807C>T)PCR反应液包括:GPIa(807C>T)正向引物、GPIa(807C>T)反向引物、GPIa(807C>T)野生型探针及GPIa(807C>T)突变型探针；GPIa(873G>A)PCR反应液包括:GPIa(873G>A)正向引物、GPIa(873G>A)反向引物、GPIa(873G>A)野生型探针及GPIa(873G>A)突变型探针；COX1(-1676A>G)PCR反应液包括:COX1(-1676A>G)正向引物、COX1(-1676A>G)反向引物、COX1(-1676A>G)野生型探针及COX1(-1676A>G)突变型探针；上述PCR反应液均还包括PCRbuffer，dNTPS、HS-Taq酶及无核酸酶水。在本专利技术提供的所述试剂盒一较佳实施例中，所述PCR反应液的成分终浓度为：1×PCRbuffer，0.1～0.3μM的各特异性引物及探针、0.2～0.3mM的dNTPS、1U的HS-Taq酶。在本专利技术提供的所述试剂盒一较佳实施例中，还包括阳性对照品一、阳性对照品二及阳性对照品三；所述阳性对照品一为GPIa(807C>T)、GPIa(873G>A)及COX1(-1676A>G)三个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的引物组，其特征在于，包括针对GPIa(807C>T)、GPIa(873G>A)及COX1(‑1676A>G)基因多态性检测的特异性引物及探针，如下：GPIa(807C>T)正向引物：5’‑CAACATCCCAGACATCCCAAT‑3’；GPIa(807C>T)反向引物：5’‑CCTATTAGCACCAAAACTTACCTTGC‑3’；GPIa(873G>A)正向引物：5’‑CATGTGATTCACCGTCAGTTACAA‑3’；GPIa(873G>A)反向引物：5’‑TATCTGCCACAGAAAATATGCTTATTC‑3’；COX1(‑1676A>G)正向引物：5’‑CACCCATCTGCACTCAAAACA‑3’；COX1(‑1676A>G)反向引物：5’‑TCTGATTCTGAGGTGAAGGCTCTT‑3’；GPIa(807C>T)野生型探针：5’VIC‑TCACAAACACATTTGGA‑MGB3’；GPIa(807C>T)突变型探针：5’FAM‑CAAACACATTCGGAGCA‑MGB3’；GPIa(873G>A)野生型探针：5’VIC‑TACCATTACTTTCGTAGCAC‑MGB3’；GPIa(873G>A)突变型探针：5’FAM‑CATTACTTTTGTAGCACTT‑MGB3’；COX1(‑1676A>G)野生型探针：5’FAM‑CCTGGCACTAATG‑MGB3’；COX1(‑1676A>G)突变型探针：5’VIC‑CCTGGCACTGATGG‑MGB3’。...

【技术特征摘要】
1.一种用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的引物组，其特征在于，包括针对GPIa(807C>T)、GPIa(873G>A)及COX1(-1676A>G)基因多态性检测的特异性引物及探针，如下：GPIa(807C>T)正向引物：5’-CAACATCCCAGACATCCCAAT-3’；GPIa(807C>T)反向引物：5’-CCTATTAGCACCAAAACTTACCTTGC-3’；GPIa(873G>A)正向引物：5’-CATGTGATTCACCGTCAGTTACAA-3’；GPIa(873G>A)反向引物：5’-TATCTGCCACAGAAAATATGCTTATTC-3’；COX1(-1676A>G)正向引物：5’-CACCCATCTGCACTCAAAACA-3’；COX1(-1676A>G)反向引物：5’-TCTGATTCTGAGGTGAAGGCTCTT-3’；GPIa(807C>T)野生型探针：5’VIC-TCACAAACACATTTGGA-MGB3’；GPIa(807C>T)突变型探针：5’FAM-CAAACACATTCGGAGCA-MGB3’；GPIa(873G>A)野生型探针：5’VIC-TACCATTACTTTCGTAGCAC-MGB3’；GPIa(873G>A)突变型探针：5’FAM-CATTACTTTTGTAGCACTT-MGB3’；COX1(-1676A>G)野生型探针：5’FAM-CCTGGCACTAATG-MGB3’；COX1(-1676A>G)突变型探针：5’VIC-CCTGGCACTGATGG-MGB3’。2.一种用于指导阿司匹林个体化用药相关基因检测的试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的特异性引物及探针的三种PCR反应液，所述PCR反应液分别为GPIa(807C>T)PCR反应液、GPIa(873G>A)PCR反应液及COX1(-1676A>G)PCR反应液，其中，GPIa(807C>T)PCR反应液包括:GPIa(807C>T)正向引物、GPIa(807C>T)反向引物、GPIa(807C>T)野生型探针及GPIa(807C>T)突变型探针；GPIa(873G>A)PCR反...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩林志，肖芳，李书，
申请(专利权)人：韩林志，
类型：发明
国别省市：湖南,43