蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术属于蜜蜂幼虫芽孢杆菌检测技术领域，公开了一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，根据P.larvae 16S rRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，弥补了现有技术的不足。本发明专利技术建立的方法特异性好，灵敏度高，重复性好，批内和批间重复性试验Ct值变异系数均小于3％；适用范围广，检测成蜂、幼虫、蜂蛹、蜂蜜、蜂胶、蜂王浆和花粉等实验室模拟样品与预期结果一致。因此，可用于蜜蜂及蜂产品中AFB的早期、高通量快速诊断及P.larvae定量分析。

【技术实现步骤摘要】
蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法
本专利技术属于蜜蜂幼虫芽孢杆菌检测
，尤其涉及一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。
技术介绍
美洲幼虫腐臭病(Americanfoulbrood，AFB)是由幼虫芽孢杆菌(Paenibacilluslarvae，P.larvae)引起的蜜蜂幼虫和蛹的一种细菌性、急性、毁灭性传染病，其典型症状为封盖后死亡的幼虫巢房盖变潮湿、下陷、颜色发暗并显油光，大部分巢房盖穿孔，挑取虫体可拉出长10cm～15cm的胶体状细丝，患病幼虫虫体变软，失去正常白色和光泽，逐渐变成淡褐色至棕黑色。这种芽孢杆菌有7层结构包围，特殊的结构使其极具生命力，在恶劣环境下仍可存活35年以上。AFB一旦在蜂场发生，极易造成幼虫死亡和蜂群群势衰弱，且很难彻底清除，给养蜂业造成重大经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为二类动物疫病和进境动物检疫疫病。目前，AFB主要根据临床症状进行诊断，易造成误诊，实验室诊断主要是以病原形态学、病原分离培养、生理生化特征、PCR方法等，确诊需要4d～6d，而且由于P.larvae的生长需要复杂的营养，在普通培养基上不能萌发也不能形成芽孢。近年来，因荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点逐渐应用于各种病原体的定性和定量检测。Han等建立了P.larvae的微流体芯片定量PCR方法，该方法只需7.9min完成30个循环，即可检测出16SrRNA基因，并可以进行熔解曲线分析，此方法是目前世界上最快的实时荧光定量分析方法。Martinez等针对P.larvae16SrRNA基因设计引物，建立了SYBRGreen荧光定量PCR检测方法，该方法用时2h，最低可检出3.75个细菌/mL和10个芽孢/mL。已报道的上述两种荧光定量PCR方法中，微流体芯片定量PCR专用仪器设备、试剂、耗材昂贵，检测成本较高，目前还不利于普及和推广应用；SYBRGreen荧光定量PCR虽检测成本低，但PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，引起假阳性，特异性较差。综上所述，现有技术存在的问题是：1.微流体芯片定量PCR检测速度快，但检测成本高，目前还不利于普及和推广应用；2.SYBRGreen荧光定量PCR检测成本低，但检测结果假阳性率高，特异性较差。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。本专利技术是这样实现的，一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法根据P.larvae16SrRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。具体的检测流程：1.DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；2.对照设置：幼虫芽孢杆菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；3.PCR反应体系配置：在PCR管中加入10×PCRbuffer2.5μL，MgCl2(25mmol)1.5μL，dNTPs(2.5mmol)2μL，上下游引物(10μmol)各1μL，特异性探针(10μmol)0.5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA1μL，加灭菌ddH2O15.0μL，使反应总体积为25.0μL；4.PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s、56℃退火延伸45s，共45个循环，在56℃时收集荧光信号；5.结果判定：阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤33，并且出现典型的扩增曲线，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品无Ct值，并且无扩增曲线，表示样品中无幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值≤33，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值>33的样品重复检测，重复检测结果无Ct值表示样品中无幼虫芽孢杆菌，重复检测结果有Ct值表示样品中存在幼虫芽孢杆菌。进一步，所述特异性引物的序列为：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。进一步，所述探针的序列为：SEQIDNO：3。本专利技术的优点及积极效果为：为建立蜜蜂幼虫芽孢杆菌(P.larvae)荧光定量PCR检测方法，根据GenBank中幼虫芽孢杆菌(P.larvae)16SrRNA基因保守序列设计特异性引物和探针，经反应体系及条件优化，建立了检测P.larvaeTaqMan荧光定量PCR方法。本专利技术与其它病原无交叉反应；最低可检出1.3×10拷贝/μL的阳性质粒，比普通PCR灵敏度高100倍；重复试验显示该方法的批内和批间变异系数均小于3％。应用本专利技术对50份实验室模拟样品和100份临床样品进行了检测，与预期结果一致。本专利技术建立的方法可用于美洲幼虫腐臭病(AFB)的早期快速检测及P.larvae定量分析；本专利技术建立的TaqMan荧光定量PCR方法，为AFB的早期诊断、防控及在分子流行病学研究等方面提供一种新的技术手段。附图说明图1是本专利技术实施例提供的阳性模板的扩增示意图；图中：M：DL2000DNAMarker；1：PCRproduct；2：Negativecontrol。图2是本专利技术实施例提供的荧光定量PCR标准曲线示意图；图中：1-7：pXT-16Srecombinantplasmiddilutedfrom1.3×107copies/μL-1.3×101copies/μL。图3是本专利技术实施例提供的荧光定量PCR特异性试验扩增曲线示意图；图中：1：P.larvae；2：Negative；3：M.pluton；4：N.apis；5：A.apis；6：Blankcontrast。图4是本专利技术实施例提供的荧光定量PCR(A)与普通PCR(B)敏感性试验示意图；图中：1-8：1.3×107copiesto1.3×100copies；9：Negativecontrol。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下面结合附图对本专利技术的应用原理作详细的描述。本专利技术实施例提供的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：1.DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；2.对照设置：幼虫芽孢杆菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；3.PCR反应体系配置：在PCR管中加入10×PCRbuffer2.5μL，MgCl2(25mmol)1.5μL，dNTPs(2.5mmol)2μL，上下游引物(10μmol)各1μL，特异性探针(10μmol)0.5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA1μL，加灭菌ddH2O15.0μL，使反应总体积为25.0μL；4.PCR反应程序：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法根据P.larvae 16S rRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。

【技术特征摘要】
1.一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法根据P.larvae16SrRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。2.如权利要求1所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述特异性引物的序列为：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。3.如权利要求1所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述探针的序列为：SEQIDNO：3。4.如权利要求1所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法检测流程为：DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；对照设置：幼虫芽孢杆菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳...

【专利技术属性】
技术研发人员：何晓杰，巴音查汗·盖力克，艾山江·塔斯坦，王振宝，叶尔保勒，苏娃，皮志媛，陈霞，李胜，叶尔兰·阿不都买金，阿斯喀·夏热甫汉，哈森，
申请(专利权)人：伊犁职业技术学院，伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心，
类型：发明
国别省市：新疆,65