本发明专利技术涉及一种白色念珠菌环介导等温扩增快速检测方法。其中的试剂包括环介导等温扩增反应液、Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶和显色剂；其中的反应液含有反应缓冲液、ｄＮＴＰ、硫酸镁、上游内引物５－ＣＡＣＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＴ－ＡＴＡＧＡＡＡＣＣＴＣＡＡＧＡＴＴＴＣＣＧＴ－３、下游内引物５－ＴＣＧＴＧＴＴＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＡＴ－ＣＴＴＴＣＴＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＧＴＡＧＡ－３、上游外引物５－ＡＣＣＧＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＣＧ－３、下游外引物５－ＴＴＡＡＣＴＴＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴ－３和甜菜碱；检测白色念珠菌的方法包括真菌ＤＮＡ的提取、白色念珠菌的环介导等温扩增、显色检测。本发明专利技术的特点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方 法，具体是一种。
技术介绍
白色念珠菌(Canidia Albicans)属于真菌界半知菌亚门一芽孢菌纲一隐球酵 母目一隐球酵母科，是双相型单细胞酵母菌。在人体中，无症状时常表现为酵母 细胞型；侵犯组织和出现症状时常表现菌丝型。白色念珠菌是一种腐物寄生菌， 广泛存在于自然界，是人体正常菌群之一，平时生存于人体的皮肤、粘膜、消化 道及其他脏器中，当机体抵抗力降低时，白色念珠菌就会繁殖，达到一定量时， 人体就会发病，所以白色念珠菌是一种条件致病菌。妇女阴道上皮细胞糖原增加， 酸性增强时，白色念珠菌会繁殖引起阴道炎，故本病常见于孕妇、糖尿病患者及 接受雌激素治疗的患者。白色念珠菌可侵犯人体许多部位，引起(1)皮肤念珠 菌病，好发于皮肤皱褶处(腑窝、腹股沟，乳房下，肛门周围及甲沟，指间)，皮 肤潮红、潮湿、发亮，有时盖上一层白色或呈破裂状物，病变周围有小水泡。(2) 粘膜念珠菌病，以鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见，在粘膜表面盖有凝乳大小不 等的白色薄膜，剥除后，留下潮红基底，并产生裂隙及浅表溃疡。(3)内脏及中枢 神经念珠菌病，可由粘膜皮肤等处病菌播散引起，有肺炎、肠胃炎、心内膜炎、 脑膜炎、脑炎等，偶而也可发生败血症。现有的白色念珠菌的检测方法有芽管法、NGL酶法、显色培养法、普通PCR、荧 光定量PCR和直接免疫荧光法等，其中芽管法和NGL酶法均易出现假阳性，特异性 不高；PCR灵敏却有高成本。环介导等温扩增方法可弥补这些不足，目前尚未见用 环介导等温扩增方法检测白色念珠菌的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，以克服 现有技术的缺点，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。本专利技术的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个 内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)， 内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随 后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启 动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA; (3)内引物以原始茎环DNA做模板，启 动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环 DNA; (4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有耙 DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使耙DNA累积到109拷贝，可通过 荧光染料来观察扩增结果。本专利技术涉及的中，包括的试剂如下 (1) - (4):(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液 其中包括10XThermopol反应缓冲液、1.0 — 1.4 mmol/L dNTP、 4一10mmol/L 硫酸镁(MgS04)、 0.8 — 1.6[Jmol/L上游引内物(FIP)、 0. 8 — 1, 6pmol/L下游内引 物(BIP)、 0.2—0.3iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 2—0. 3iJmol/L下游外引物(B3) 和l一1.5mol/L甜菜碱； 上游内引物5- CACATTTTGGATAAGGTTCACCATT-ATAGAAACCTCAAGATTTCCGT -3 、下游内引物5画TCGTGTTCGTGAAAGTGAAGATAAT陽CTTTCTATCATCCAAATCGTAGA-3 、 上游外引物5-ACCGTTGATTTCCAATTCG-3、 下游外引物5墨TTAACTTGAGCCATGGAGAT陽3 、其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。其中所述的10XThermopol反应缓冲液中含有200隱ol pH8.8的三羟基甲基氨 基甲烷一盐酸(Tris—HC1)、 100 mmol/L氯化钾(KC1)、 100鹏ol/L硫酸铵((NH4) 2S04)、 20咖ol/L硫酸镁(MgS04)和1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) UNG酶1 U/pL;(3) Bst DNA聚合酶8 U /|jL;(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管共有22pL，其最佳组成为2. 5|JL10XThermopol反应缓冲液、1. 4yL 25mmol/L dNTP (四种脱氧核糖核酸的混合物)、 4.0pL 10iJmol/L上游内引物(FIP)、 4. OyL 10iJmol/L下游内引物(BIP)、 0. 5pL 1(Hmo1/L上游外引物(F3)、 0.5pL 10iJmol/L下游外引物(B3)、 2pL 100 mmol/L MgS04、 5|JL 5M甜菜碱和2. 1|JL ddH20 (灭菌双蒸水)。使用上述方法检测白色念珠菌，依次包括下列步骤(1) _ (3):(1) 待检样品或真菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D26。/0D28。在1.6-2.0范围内，浓度 在10-100 ng/iJL范围内。(2) 进行白色念珠菌的环介导等温扩增反应A. 在装有22pL LAMP反应液的反应管中加入2IJL待检模板DNA,和O. 5yL的UNG 酶，于恒温水浴上5(TC放置3 min， 95。C放置3—5 min，立即置于冰上1一3 min;B. 在反应管中加入1IJL Bst DNA聚合酶，并于水浴锅中恒温水浴上60—65'C 扩增反应45—90 min;C. 将水浴调到80—85'C终止反应，3—5min后取出待检；(3) 显色检测在待检的每个反应管中加入lpL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜 色变为绿色，说明待检样品含有或为白色念珠菌。本专利技术是根据白色念珠菌SAP基因的六个序列设计了两个特异性内引物和两个 特异性外引物，该基因序列为白色念珠菌各不同菌株型所共有，以保证检测不同 来源的白色念珠菌的可靠性。本专利技术采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术 特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通 的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可， 简单而快速，特别适用于基层医疗机构。 具体实施例方式下列实施例进一步说明本专利技术，但不应当作对本专利技术的限制。 实施例l按下列配方制作白色念珠菌的环介导等温扩增反应液 (1) LAMP反应液含有2.5nL 10XThermopol反应缓冲液、1. 4|jL 25咖ol/L dNTP (四种脱氧核 糖核酸的混合物)、4.0iJL10iJmol/L上游内引物(FIP)、 4. O(JL 10iJmol/L下游内引 物(BIP)、 0.5|JL 10pmol/L上游外引物(F3)、 0. 5|JL 10ijmol/L下游外引物(B3)、 2|JL 100 mmol/L MgS04、 5|jL 5M甜菜碱和2. lpL ddH20 (灭菌双蒸水)。其中所述的上游内引物 5- CACATTTTGGATAAGGTTCACC本文档来自技高网...
【技术保护点】
环介导等温扩增检测白色念珠菌的试剂，其特征是该试剂包括（１）－（４）： （１）环介导等温扩增反应液： 包括１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反应缓冲液、１．０－１．４ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ、４－１０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁（ＭｇＳＯ４）、０．８－１．６μｍｏｌ／Ｌ上游引内物（ＦＩＰ）、０．８－１．６μｍｏｌ／Ｌ下游内引物（ＢＩＰ）、０．２－０．３μｍｏｌ／Ｌ上游外引物（Ｆ３）、０．２－０．３μｍｏｌ／Ｌ下游外引物（Ｂ３）和１－１．５ｍｏｌ／Ｌ甜菜碱；其中１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反应缓冲液含有２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．８的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、１００ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸铵、２０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁和１％曲拉通Ｘ－１００； 其中，上游内引物： ５－ＣＡＣＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＴ－ＡＴＡＧＡＡＡＣＣＴＣＡＡＧＡＴＴＴＣＣＧＴ－３； 下游内引物： ５－ＴＣＧＴＧＴＴＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡＡＴ－ＣＴＴＴＣＴＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＧＴＡＧＡ－３； 上游外引物：５－ＡＣＣＧＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＣＧ－３； 下游外引物：５－ＴＴＡＡＣＴＴＧＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴ－３； （２）ＵＮＧ酶：１Ｕ／μＬ； （３）Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶：８Ｕ／μＬ； （４）显色剂：为１０％的荧光染料ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉ或者ＤＮＡＧｒｅｅｎ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：雷质文，贺楠，姜英辉，刘云国，房保海，李正义，唐静，马维兴，张健，祝素珍，贾俊涛，赵丽青，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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