利用分子标记技术区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法技术

利用分子标记技术区分风尾菇与糙皮侧耳的方法，包括菌丝的培养与收集、基因组ＤＮＡ的提取、ＩＴＳ－ＰＣＲ扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测。本发明专利技术的方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，只需２－３天时间；以基因组ＤＮＡ为材料，准确性高、重复性好；检测结果一目了然，容易判断等优点，有效纠正了生产和科研用的糙皮侧耳菌株与凤尾菇菌株相互混淆现象。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用分子标记技术鉴别食用菌的方法， 确切地说是一种利用分子标记技术快速区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法。
技术介绍
凤尾燕(plcurolus pulmonarius (Fr， )Sing.)是热 带和亚热带地区的一种食用菌。又称印度鲍鱼菇、环柄侧耳等。凤尾菇栽 培粗放，生产周期短，出菇温度范围广。1974年印度首先开始人工栽培凤尾菇。1980年凤尾菇人工栽培技术 引入我国，现分布各省栽培。在不少有关食用菌产量统计或栽培技术介绍 的文章和书籍中，常见凤尾菇与糙皮侧耳归在一起。凤尾菇和糙皮侧耳在 子实体的形态上难以区分，虽然两者在菌盖颜色深浅、厚度，担孢子大小 有细微的差别，凤尾菇的生长速度比糙皮侧耳的快些，但仅凭这些特点仍 然很难区分凤尾菇与糙皮侧耳；凤尾菇与糙皮侧耳的一个较显著的差别 是两者在野外发生的季节不同，在欧洲和北美糙皮侧耳通常出现在深秋 和冬季，而凤尾菇的子实体则出现在仲夏和早秋。所以在生产上仅靠子实 体形态判别它们，就可能引起菌种的混淆。由于凤尾菇和糙皮侧耳在子实体的形态上难以区分，因此，探索快速 鉴别凤尾菇真伪的方法，主要是探索快速有效地鉴别凤尾菇与糙皮侧耳的 方法
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用分子标记技术快速区分 凤尾菇与糙皮侧耳的方法，以免在科研和生产上引起混乱，造成不必要的 损失。本专利技术的，包括菌丝 的培养与收集、基因组DNA的提取、ITS-PCR扩增、特异酶切片段标记的 产生和酶切产物的电泳检测；其特征在于1、特异酶切片段标记的产生:在4 8plPCR扩增产物，加入l plHae III酶的酶切Buffer, 0.3 1 fil HaeIII酶，2.2~ 2.8[il ddH20， 37。C水浴4 10 h; 所述Haein酶的酶切Buffer成份为100mmoL/L Tris-HCl, pH7.5， 100mmoL/L MgCl2， 10mmoL/L Dithiothreitol和500 mmoL/L NaCl;2、酶切产物的电泳检测取HaeIII酶的酶切产物lOuL，与2"L上 样缓冲液混匀，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，于0.5XTBE缓冲液中， 5V/cm电压下电泳；经电泳检测，分子量为425 435bp和175 185bp 的DNA标记条带，是凤尾燕菌株的标志；分子量为235 245 bp和175 200bp的DNA标记条带，是糙皮侧耳菌株的标志。所述上样缓冲液0.1 %溴酚蓝，40%蔗糖。本专利技术的，该方法 与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确 性高、容易判断、重复性好等优点。1、 检测时间短该检测所需时间短， 一般只需要2 3天，而常规的 拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少2个月的时 间，形态学检测需要综合分析菌丝体阶段与子实体阶段的微观与宏观的特 征，所需时间与出菇试验相当。2、 准确性高、重复性好本专利技术以基因组DNA为材料，DNA是稳 定的遗传物质，是区分物种的本质表现所在，而DNA序列中的保守序列 更是稳定，是物种长期进化的分子标记，不易受外界因素等的影响，因此 以保守序列开发的鉴定技术准确性高，有很强的重复性；然而常规形态学 检测、拮抗试验、出菇试验容易受到环境条件、鉴定者的知识水平等因素 影响，已经造成判断上的混乱。3、 容易判断本专利技术的判断依据是在琼脂糖电泳上出现的DNA标 记条带，DNA标记条带少、清晰， 一目了然，不会出现像常规形态学检 测、拮抗试验、出菇试验上模棱两可的现象，而给判断造成误差。附图说明 图1为HaeIII酶的酶切电泳图；1 M为泳道编兮；右 侧的数字表示DNA片段的分子量。图中，1 5泳道和7 8泳道所示的 分子量为430bp和182 bp的DNA标记条带，是凤尾菇菌株的标志；6和 9泳道所示的分子量为243bp和190bp的DNA标记条带，是糙皮侧耳菌 株的标志。具体实施方法 为了充分公开本专利技术的利用分子标记技术区分凤 尾燕与糙皮侧耳的方法，以下结合实施例加以说明。实施例一 ，具体包括以下步骤一、菌丝培养与收集(一) 若测试菌株保藏时间小于6个月，则菌丝培养按如下方法进行1、 用接种耙耙碎含凤尾菇菌丝的PDA培养基，转接入250 ml三角瓶， 含100 ml PDA液体培养基中；2、 放置在25。C摇床上，转速90 130r/min培养7 10d;3、 用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；4、 称取0.5 1.3g菌丝,用滤纸包好，保存于-2(TC备用。(二) 若测试菌株保藏时间大于6个月，则菌丝培养采用如下方法1、 取凤尾菇菌种豆块大小转接到PDA斜面上，25"培养7 10天；2、 用接种耙耙碎含菌丝的PDA培养基，转接入250ml三角瓶，含 100 ml PDA液体培养基中；3、 放置在25。C摇床上，转速卯 130r/min培养7 10d;4、 用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；5、 称取0.5 1.3g菌丝,用滤纸包好，保存于-2(TC备用。二、基因组DNA的提取，所述基因组DNA可以从菌株的菌丝体或子实 体中提取。1、 取保存备用的菌丝l包或0.5 1.3g的子实体，放入研钵，加入液氮迅速研磨 成粉末，转入7ml的离心管；2、 加2. 5mL 65。C预热的抽提液，同时加入50 pl巯基乙醇，上下震荡， 使蛋白质变性沉淀；3、 65。C水浴lh，每隔10min振荡1次；4、 加入2.5 ml的氯仿异戊醇混匀，除去蛋白质；5、 8000 r/min， 4。C离心10min，取上清到7ml管；6、 加1/5体积65。C预热的CTAB/NaCl混匀，加入2. 5 ml的氯仿异 戊醇混匀；7、 10000r/min， 4。C离心10min，取上清；8、 加入2. 5ml 65。C预热的CTAB沉淀液，颠倒混匀，65。C水浴lh 至沉淀可见或可过夜；9、 12000r/min，4。C离心10min后，小心去除上清液；10、 用0.5ml TE溶液或无菌水溶解沉淀10min;11、 加入0. 25ml饱和酚和0. 25m L氯仿异戊醇，混匀；12、 12000 r/min， 4。C离心10min，取上清，加入2倍体积预冷的无 水乙醇，混匀；13、 放置-2(TC冰箱lh或过夜；14、 12000 r/min， 4。C离心10 min，弃上清；15、 可选做步骤加O. 5 1 mL 70%乙醇洗涤，12000 r/min， 4°C 离心8min，弃上清；重复一次16、 自然风干沉淀，用30^TE溶液或无菌去离子水溶解沉淀，-2CTC 保存备用。三、 ITS-PCR扩增ITS-PCR扩增反应体系1 fil含量1(K40ng的DNA， 2. 5 pi 10XPCR buffer, 2 pl浓度为2.5 mmol/L的dNTP， 1 )il浓度为10 U mol/L的 ITS1, 1 jil浓度为10 mol/L的ITS4， 0.3 pl酶活为5 U/ul的TaqDNA Polymerase, 17.2 jil ddH20。ITS-PCR扩增反应程序94。C预变性5min; 94。C变性45s， 55。C退 火45 s，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用分子标记技术区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法，包括菌丝的培养与收集、基因组ＤＮＡ的提取、ＩＴＳ－ＰＣＲ扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测；其特征在于　（１）特异酶切片段标记的产生：在４～８μｌ　ＰＣＲ扩增产物，加入１μｌ　ＨａｅⅢ酶的酶切Ｂｕｆｆｅｒ，０．３～１μｌ　ＨａｅⅢ酶，２．２～２．８μｌ　ｄｄＨ↓［２］Ｏ，３７℃水浴４～１０ｈ；　（２）酶切产物的电泳检测：取ＨａｅⅢ酶的酶切产物１０μＬ，与２μＬ上样缓冲液混匀，点样于１．２％的琼脂糖凝胶上，于０．５Ｘ　ＴＢＥ缓冲液中，５Ｖ／ｃｍ电压下电泳；经电泳检测，分子量为４２５～４３５ｂｐ和１７５～１８５ｂｐ的ＤＮＡ标记条带，是凤尾菇菌株的标志；分子量为２３５～２４５ｂｐ和１７５～２００ｂｐ的ＤＮＡ标记条带，是糙皮侧耳菌株的标志。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘新锐，吴小平，谢宝贵，邓优锦，朱坚，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]