利用分子标记技术鉴定猴头菇菌种猴王的方法技术

利用分子标记技术鉴定猴头菇菌种猴王的方法包括菌丝培养与收集、基因组ＤＮＡ的提取、ＳＣＡＲ－ＰＣＲ分子标记的检测建立和ＳＣＡＲ－ＰＣＲ产物的检测。本发明专利技术使用２对不同的引物猴王Ｆ１／Ｒ１和猴王Ｆ２／Ｒ２，对供测试的菌株进行ＳＣＡＲ－ＰＣＲ分子标记的检测和ＳＣＡＲ－ＰＣＲ产物的检测；当使用猴王Ｆ１／Ｒ１检测引物时，ＳＣＡＲ－ＰＣＲ产物的检测结果在ＤＮＡ图谱中显示的分子量为１０１２ｂｐ的特异ＤＮＡ条带，为猴头菇菌种猴王的标志；当使用猴王Ｆ２／Ｒ２检测引物时，ＳＣＡＲ－ＰＣＲ产物的检测结果在ＤＮＡ图谱中显示的分子量为３７１ｂｐ的特异ＤＮＡ条带，为猴头菇菌种猴王的标志。

【技术实现步骤摘要】
利用分子标记技术鉴定猴头燕菌种猴王的方法
本专利技术涉及一种微生物的鉴定方法，具体涉及利用分子 标记技术鉴定猴头菇菌种猴王的方法，属生物

技术介绍
猴头菇(Z/en'c/Mm er/wac醋)肉嫩味美，营养丰富。很早 以前，人们把它与熊掌、海参、鲨鱼翅并列为"四大名菜"，有"山珍猴头， 海味燕窝"的美称，在古代被作为贡品。人体必需的9种氨基酸，猴头菇都 含有。据报道，猴头菇所含有的营养成分与目前人工栽培的其它食用菌品 种相比都居第一、二位，因而显得更加珍贵。我国食用菌资源丰富，品种比较多，但是由于部分生产者有意或无意 的改名，造成猴头菇的栽培菌种存在"异种同名或同种异名"的混乱现 象。这种现象极大地损害了育种者和生产者的利益，不但给科学研究和学 术交流带来障碍，而且对规范生产和产品质量标准的制定带来很大困难。优质菌种在猴头菇单产和质量中的贡献举足轻重，这决定了猴头菇菌 种在猴头菇产业中的重要地位。随着大规模的工厂化栽培方式的出现，对 猴头菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要更为简便、快速、准确的菌株 鉴定技术，以保证每批次的用种都准确无误。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用分子标记技术鉴定猴头 菇菌种猴王的快速检测方法。本专利技术的利用分子标记技术鉴定猴头燕菌种猴王的方法有2种，2种 鉴定方法都包括菌丝培养与收集、基因组DNA的提取、SCAR-PCR分子标记 的检测建立和SCAR-PCR产物的检测； 方法一的特征在于1、 SCAR-PCR分子标记的检测，使用的检测引物是猴王F1/R1，其中， 猴王Fl是5'-CTCCTCCCTTCACAATAAATAGCCA-3'，，猴王Rl是 5'隱TCCCTGAACTTCTTTGTCTTCCCGT-3';2、 SCAR-PCR分子标记的检测建立SCAR-PCR扩增体系为10XPCR buffer 2. 5 |_il， 25画1/L MgCL2 1 (il， 2.5 m mol/L dNTP 2 |il， 5固TaqDNA Polymerase 0.3 |al， 10 y mol/L检测引物各1 pl， lng 10ng/(il模板 DNA 1^1， ddH20 16.2 (il;SCAR-PCR反应条件为94。C lmin; 94°C 45second， 62°C 45second， 72°C lmin， 30个循环；72°C 5min;3、 SCAR-PCR产物的检测结果在电泳检测的DNA图谱中显示，扩增 出的分子量为1012bp的特异DNA条带，为猴头菇菌种猴王的标志。方法二的特征在于1、 SCAR-PCR分子标记的检测，使用的检测引物是猴王F2/R2，其中， 猴王F2是5'-CCCTCCACAACCACCACAAGATAAT陽3'，猴王R2是 5'-CTCCTCGCCGTCTGCATAAGAACTC-3,;2、 SCAR-PCR分子标记的检测建立SCAR-PCR扩增体系为10XPCR buffer 2. 5 pl， 25mmol/L MgCL2 1 |il， 2.5 m mol/L dNTP 2 (il， 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 fil， 10 u mol/L检测引物各1 pl， lng 10ng/Vl模板 DNA l^d， ddH20 16.2 pi;SCAR-PCR反应条件为94°C lmin; 94°C 45second， 67°C 45second， 72°C lmin， 30个循环;72°C 5min;3、 SCAR-PCR产物的检测结果在电泳检测的DNA图谱中显示，扩增 出的分子量为371bp的特异DNA条带，为猴头菇菌种猴王的标志。本专利技术提供的利用分子标记技术鉴定猴头菇菌种的方法，具有灵敏 度高，所需要的DNA用量少，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验 相比，具有检测时间短、准确性高、容易判断、重复性好等优点。具体如 下1、 检测时间短该检测方法所需时间只需要2 — 3天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，常规形态学检测和出菇试验则需要至少2个月的时间。2、 准确性高、容易判断，而且重复性好该检测方法以基因组DNA 为材料，DNA是稳定的遗传物质，不易受外界因素等的影响，同时它的 1012bp或371bp的显性标记判断一目了然，减少人为判断的偏差，大大提 高了准确性；常规的拮抗试验中，拮抗表现形式至少有3种，甚至更多， 有时表现形式不明显，还受培养环境的影响，拮抗表现不仅在种内的不同品种之间会出现，同时在种间的菌株之间也会表现出来，给准确判断造成 困难；出菇试验更容易受到环境、时间等各方因素的影响，重复性差，加 大了检测困难；形态学检测在同一属种内的不同品种之间可区别的特征 少，有些甚至没有什么差异，同时还需要判断者具有丰富的知识与经验， 方可做出准确的判断。3、此外该方法得到的显性标记可减少猴头菇新品种认定的工作量， 检测时该方法只需要1个阳性菌株和1个阴性菌株对照便可快速比较，而 用常规形态学、拮抗试验、出燕试验方法来认定一个新品种，需要将所有 同种内的不同品种一起搬出来比较，才能做出正确的认定，这就要很大的 人力和物力，当品种多时可能使得认定工作无法进行。本专利技术对猴头菇种质资源的利用和新品种的登记工作，提供了更为有 效的菌种鉴定体系，以及加强对我国猴头燕种质资源的保护工作都具有重 要意义。附图说明 图1为采用第一种方法检测猴头菇菌种扩增的DNA图 谱。其中1 M为泳道编号；右侧的数字表示DNA片段的分子量，箭头 所指是猴王菌株特异性标记。图2为采用第二种方法检测猴头菇菌种扩增的DNA图谱。其中M 17为泳道编号；左侧的数字表示DNA片段的分子量，箭头所指是猴王菌 株特异性标记。具体实施方式 为了充分公开本专利技术的利用分子标记技术鉴定猴 头菇菌种猴王的方法，以下结合实施例加以说明。实施例1: 一种 一种，包括以下步骤一、菌丝培养与收集(一)若供测试猴头菇菌株的保藏时间小于6个月，则菌丝培养按如 下方法进行1、 用接种耙耙碎含猴头菇菌丝的PDA培养基，转接入250 ml三角瓶， 含100 ml PDA液体培养基中；2、 放置在25。C摇床上，转速卯 130r/min培养7 10d;3、 用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；4、称取0.5 1.3g菌丝，用滤纸包好，保存于-2(TC备用。 (二)若供测试猴头菇菌株保藏时间不小于6个月，则菌丝培养采用 如下方法1、 取猴头菇菌种豆块大小转接到PDA斜面上，25'C培养7 10天；2、 用接种耙耙碎含猴头菇菌丝的PDA培养基，转接入250 ml三角瓶， 含100 ml PDA液体培养基中；3、 放置在25。C摇床上，转速90 130r/min培养7 10d;4、 用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；5、 称取0.5 1.3g菌丝,用滤纸包好，保存于-2(TC备用。二、基因组DNA的提取，所述基因组DNA可以从菌株的菌丝体或子 实休中提取。1、 取保存备用的猴头菇菌丝0.5 1.3§，或子实体0.5 1.3g，放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7ml的离心管；2、 加2.5 mL 65。C预热的抽提液，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用分子标记技术鉴定猴头菇菌种猴王的方法，包括菌丝培养与收集、基因组ＤＮＡ的提取、ＳＣＡＲ－ＰＣＲ分子标记的检测建立和ＳＣＡＲ－ＰＣＲ产物的检测；其特征在于　（１）ＳＣＡＲ－ＰＣＲ分子标记的检测，使用的检测引物是猴王Ｆ１／Ｒ１，其 中，猴王Ｆ１是５′－ＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡ－３′’，猴王Ｒ１是５′－ＴＣＣＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＴＧＴＣＴＴＣＣＣＧＴ－３′；　（２）ＳＣＡＲ－ＰＣＲ分子标记的检测建立：ＳＣＡＲ－ＰＣＲ扩增体系为１０×ＰＣ Ｒｂｕｆｆｅｒ　２．５μｌ，２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣＬ↓［２］　１μｌ，２．５ｍ　ｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　２μｌ，５Ｕ／ｕｌ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　０．３μｌ，１０μｍｏｌ／Ｌ检测引物各１μｌ，１ｎｇ～１０ ｎｇ／μｌ模板ＤＮＡ　１μｌ，ｄｄＨ↓［２］Ｏ　１６．２μｌ；　ＳＣＡＲ－ＰＣＲ反应条件为９４℃　１ｍｉｎ；９４℃　４５ｓｅｃｏｎｄ，６２℃　４５ｓｅｃｏｎｄ，７２℃　１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃　５ｍｉｎ；　（３ ）ＳＣＡＲ－ＰＣＲ产物的检测结果：在电泳检测的ＤＮＡ图谱中显示，扩增出的分子量为１０１２ｂｐ的特异ＤＮＡ条带，为猴头菇菌种猴王的标志。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓优锦，谢宝贵，江玉姬，刘新锐，温志强，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]