运用复合PCR技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法技术

一种运用复合ＰＣＲ技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法，使用分别根据腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶ＦＵＭ１基因和丝氨酸－十六酰基转移酶基因ＦＵＭ８设计的引物对ｒｐ３２／ｒｐ３３和ｒｐ６７９／ｒｐ６８０和镰刀菌属特异性引物ＩｔｓＦ／ＩｔｓＲ。在同一反应体系中同时检测腐马素产毒菌株，不仅可以检测到未知的腐马素产毒菌株，而且能同时鉴别所测菌株是否属于镰刀菌属。采用复合ＰＣＲ技术，多对引物在同一反应体系中同时扩增，提高了检测的准确性，节约了检测时间，是一种简单、有效、快速的芦笋中腐马素产毒菌株的复合ＰＣＲ检测方法。可以试剂盒的形式大规模推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术"运用复合PCR技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法"，属于农作物病害防治 和植物检疫

技术介绍
卢笋作为一种食药兼用的高档蔬菜，不仅口味鲜美，还是当今世界发现和公认的防癌抗 癌效果最好的植物，深受国内外广大消费者的喜爱。我国是世界上最大的芦笋生产国和出口 国，主要的芦笋种植区分布在山东、江苏、浙江、山西、福建、河北等省份，生产的芦笋大 部分用于出口。腐马素是一组主要由串珠镰刀菌(Fwrar/ww ver"c////o/<sfey)和再育镰刀菌(i^yan、wpra/^rartwO等镰刀菌属真菌产生的真菌毒素，具有分布广，毒性强的特点。已成为继黄曲霉素之后的又一个真菌毒素研究的新热点。现已鉴定到28种腐马素类似物(Hlywka andBullerm叫1999)，它们被分为4组，即A、 B、 C和P组。其中，B组腐马素是野生型菌株中产生量最为丰富的一组。目前已发现的腐马素有FA1、 FA2、 FB1、 FB2、 FB3、 FB4、 FC1、FC2、 FC3、 FC4禾B FP1共11种，其中FBI是其主要组分，占75%以上，而且毒性最强。许多证据表明，腐马素对某些牲畜有急性致命毒性及潜在的致癌性，如引起马脑炎、猪肺水肿或大鼠肝癌等，为畜牧业带来很大的损失。流行病学研究也认为，食用腐马素会引起人类食道癌和神经管缺陷，严重威胁食品安全及人类和动物健康。在2003年，国际癌症研究机构(International Agency of Research Cancer, IARC)估测由串珠镰刀菌产生的腐马素(FBI)为2B组，即可疑人类致癌物。目前，在许多国家如美国、意大利、德国、荷兰、南非和澳大利亚等的戸笋产区，镰刀菌侵染引起的病害己是芦笋上的主要病害，并且己有研究报导了 FB1， FB2在田间芦笋上的发生，严重影响戸箅的产量和产品质量。而串珠镰刀菌和再育镰刀菌是戸笋中极为常见的病原真菌，发生非常普遍，并且通常情况下大部分植株在田间感染了致病菌之后无明显症状，一些无明显霉变症状的产品也可能有腐马素污染。中国是世界上已经确认的食品中腐马素的污染与食道癌的发生关系密切的两个国家之一，因此控制芦笋、玉米等食品中腐马素的污染是当务之急，在农业生产和食品安全领域都有非常重要的意义。较全面地了解主要产地中芦笋上腐马素产毒菌株污染情况，建立完善、快捷的腐马素及其产毒株的检测手段和监控机制也势在必行。只有这样才能及时有效地发现和控制有关腐马素的污染，及时采取措施，从而提高我国农产品在国际市场上的质量和信誉， 保证国际贸易的顺利进行，保护广大农民的切身利益。传统的腐马素产毒菌株的分类和鉴定方法主要为形态学方法，该法需要较高的专业素质 和经验并需要通过菌株分离，培养，纯化，促进产孢等一系列过程，需时约30天，费时费力。 在生产实际鉴定应用和科研中，都有较大局限性。随着对腐马素研究的深入，其生物合成途 径巳基本阐明，使利用分子生物学方法对腐马素产毒菌株分类和鉴定成为可能。目前分子检 测手段大多以分类学基因和腐马素生物合成所必需的聚酮化合物合成酶基因FC/M/为基础 的，设计组特异性或属特异性引物进行PCR扩增检测，耗时可縮短到2天。但是，由于分类 学基因是基于镰刀菌属内各个种的同源序列设计的，直接揭示菌株种类，而并不能直接揭示 待测菌株的产毒性，很可能将未知的腐马素产毒菌株排除在外。而目前扩增直接与腐马素产 毒机制相关基因的弓I物是基于巳知产毒菌株F vw/ZdWo/tfes的^T/AW基因序列设计的，但腐 马素的合成是一个比较复杂的过程，多种基因的参与和调节，对于Ff/M/基因的单一检测并 不能完全保证结果的可靠性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种简单、有效、快速的芦笋中腐马素产 毒菌株的复合PCR检测方法。本专利技术检测方法，使用分别根据腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶FMl//基因 和丝氨酸-十六酰基转移酶基因FC/MS设计的引物对rp32/rp33和rp679/rp680，并与镰刀菌属 特异性引物ItsF/ItsR—起，通过实验比较得到了特异性最佳的引物配组。在同一反应体系中 检测腐马素产毒菌株，是对仅根据分类学基因及F(/A^基因设计特异性引物检测方法的补充 和改进。检测步骤为对待检样品进行菌株分离和纯化；SDS法提取样品模板DNA;经复合 PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分 析可得出检测结果。本专利技术检测方法不仅可以检测到未知的腐马素产毒菌株而且能同时鉴别 所测菌株是否属于镰刀菌属。同时，本方法采用复合PCR技术，多对引物在同一反应体系中 同时扩增，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在我国大规模推广。 本专利技术通过以下技术方案实现 第一步菌株的分离，纯化将芦笋样品，经清洗、切段、消毒、冲洗、无菌条件下，将样品平铺到PDA (马铃薯-葡萄糖-琼脂)培养基上，置于培养箱中培养；经培养后将不同真菌分别接种到PDA培养基上纯化培养；对纯化了的菌株进行单孢分离，获得单孢培养物，保存备用。 第二步改良的SDS法提取样品模板DNA样品中DNA的提取方法采用改良的SDS提取法将菌株培养在50 ml的液体酵母培养基中，27'C200rpm/min的振荡条件下培养3-5天；用滤纸过滤，抽滤收集孢子，在液氮中磨成粉，将粉末收集在50ml的试管中；在试管中加入4 ml DNA提取液(200 mM Tris-HClpH=8.5， 250mMNaCl， 25mM EDTApH=8.0， 0.5%(W/V) SDS)并且涡旋使其充分混合；力口入2 ml的苯酚和1.5 ml氯仿，涡旋振荡，2500g离心15 min;将上清液转移到2 ml的离心管中，每支中加上清液90(^1，氯仿900W， 13200rpm离心5 min;将上层溶液转移到新的2 ml试管中，加入RNaseI (终浓度C^lOOpg/ml); 37'C培养2-3h;加入等体积的冷的5M氯化锂溶液，轻轻振荡充分混合，在冰上再放置15min; 4。C下13200 rpm离心lOmin，然后将所有的上清液一起都放在一个50 ml的试管中；加入2.5倍体积的100%乙醇，在水和乙醇的交界处形成一层DNA团，然后混合；4'C3000g离心20min，弃取上层清液；加20ml70。/。的冷乙醇，然后在4t:下过夜，让杂质溶解；4。C3C)00g离心20min，弃去上层清液；沉淀在空气中干燥15 min，然后加入300-400|il重蒸水,在4'C下溶解过夜；用移液器吸取溶液的办法使其混匀，获得样品模板DNA。模板DNA母液贮存条件为-80 °C;使用前稀释成浓度为50 ng/pl溶液，存放在-20 "C条件下。 第三步PCR引物设计使用分别根据聚酮化合物合成酶F[/M/基因、丝氨酸-十六酰基转移酶基因F(7MS设计的引物对rp32/rp33和rp679/rp680和镰刀菌属特异性引物ItsF/ItsR,通过实验比较得到了特异性最佳的引物配组。其引物序列如下rp32 ACAAGTGTCCTTGGGGTCCAGG rp33 GATGCTCTTGGAAGTGGCCTACG r本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种运用复合ＰＣＲ技术检测芦笋中腐马素产毒菌株的方法，其特征在于：使用分别根据腐马素生物合成所必须的聚酮化合物合成酶ＦＵＭ１基因和丝氨酸－十六酰基转移酶基因ＦＵＭ８设计的引物对ｒｐ３２／ｒｐ３３和ｒｐ６７９／ｒｐ６８０和镰刀菌属特异性引物ＩｔｓＦ／ＩｔｓＲ，通过实验比较得到了特异性最佳的引物配组；在同一反应体系中同时检测腐马素产毒菌株；其检测步骤为：对待检样品进行菌株分离和纯化；ＳＤＳ法提取样品模板ＤＮＡ；复合ＰＣＲ反应；经电泳、染色、漂洗，用自动凝胶成像系统观察、扫描并储存电泳结果，最后经过谱图分析，得出检测结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪俏梅，魏佳，王建升，周莹，杜良成，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]