本发明专利技术公开了一种用于检测Ｆｒｉｅｎｄ鼠白血病病毒载量的标准品，以及用该标准品通过实时荧光定量聚合酶链式反应方法（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ法）检测Ｆｒｉｅｎｄ鼠白血病病毒载量的方法。在检测过程中包括白血病病毒核酸（ＲＮＡ）的提取及含量测定、用引物对逆转录扩增获得核酸片段、实时荧光定量聚合酶连式反应（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）检测等步骤，本发明专利技术检测Ｆｒｉｅｎｄ鼠白血病病毒载量与常规ＰＣＲ检测方法相比，具有较好的特异性，所检测的基因扩增产物为欲检测的目的基因产物，并且具有较好的线性关系，适合应用于对Ｆｒｉｅｎｄ鼠白血病病毒（Ｆｒ．ＭｕＬＶ）载量的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种用于检测Friend鼠白血病病毒 (Fr. MuLV)载量的标准品以及用该标准品通过实时荧光定量聚合酶链式反 应方法(Real-time RT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)载 量的方法。技术背景白血病病毒(leukemia virus),是一类肿瘤病毒，它是骨髓性白血病 或淋巴性白血病等各种白血病的病因，有许多毒株。在组织培养的细胞体系 中，有时可以引起骨髓芽球和淋巴球等特定的靶细胞发生转化，但缺乏普遍 性。感染于纤维芽细胞后会发生增殖，但不引起转化。主要有三类(1)禽 白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV):为V. Ellerman禾口 0. Bang (1908) 所分离。(2)鼠白血病病毒(Murine leukosi s virus, MuLV): 由L. Gross (1951)分离，后来又从自然产生的及放射线或致癌物诱发的白血病体中分 离出来。(3)其他1960年以后自各种实验动物及猿猴中分离的白血病病毒， 主要是猫白血病病毒(Feline leukemixvirus， FeLV)。有的毒株不仅能使 原来的寄主动物发生白血病，还可引起不同种类的动物发病。同时，它和具 有共同寄主的肉瘤病毒关系密切，其中的缺陷毒株(不完全病毒)可作为疱 疹病毒起作用，而完全型肉瘤病毒能制备基因重组体。在同种病毒中，也有 的以内在病毒的形式，处于整合到正常动物基因中的状态，并通过生殖细胞 一代代传递下去。目前国内外尚无检测Friend鼠白血病病毒(Fr. MuLV)载量方法的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准 品，本专利技术的另一个目的在于提供一种用该标准品通过实时荧光定量聚合酶 链式反应方法(Real-time RT-PCR法)检测Friend鼠白血病病毒载量的方 法。本专利技术目的是通过如下技术方案实现的本专利技术提供的用于检测Friend鼠白血病病毒载量的标准品，其包含用 引物对逆转录扩增获得核酸片段，其中所述病毒基因序列的引物对分别是5' -CAACCACCCTCTGTGGACTT-3'和5' -TGTAAACCGGATAGCCAAGG-3';5' -CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3'和5' -CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3';5' -GTGGCCTACCTGTCCAAAAA-3'和5' -GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3';5' -CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3'和5' -AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3';上述引物依次如SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8所本专利技术用上述标准品通过实时荧光定量聚合酶连式反应方法(RT-PCR 法)检测Friend鼠白血病病毒载量的方法包括如下步骤(1) 制作病毒液将Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)按I:IO用磷酸盐缓冲溶液(PBS) 稀释，给小鼠腹腔注射，每只0.3ml，待发病后，脾脏无菌取出，研磨，用 DMEM制成每体积份含O. l重量份脾脏的悬液，在4 T下以2X103 r /min的 速度离心10-15 min，取上清液作为病毒液，备用；(2) 制作标本取小鼠，用上述病毒液腹腔注射，感染小鼠，解剖取脾组织，冻存于 -8(TC，备用；(3) 白血病病毒核酸(RNA)的提取及含量测定总RNA提取将上述作为标本的小鼠脾组织放入研钵中，加入液氮，研 磨，待组织变软，再加液氮，再研磨；将研碎的小鼠脾组织转入离心管中， 每50 100mg小鼠脾组织加入lmlTrizol试剂，混合至重悬；水平放置离心管， 室温孵育20min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min;移上清液入l. 5ml离 心管中，加入0.2ml氯仿，摇动离心管15s，室温孵育2 3min;于4"C下以 12000rpm的速度离心15min;移上层水相到l. 5ml离心管中，加入O. 5ml异丙 醇，混匀，室温孵育30min，于4。C下以12000rpm的速度离心10min，弃上清 液，在沉淀中加入lml 75%乙醇，于4。C下以7500rpm的速度离心5min，弃上清液，干燥沉淀，得总RNA;总RNA含量测定总RNA用DEPC处理水(RNase-free水)稀释60倍，用核 酸定量仪内置的RNA测定程序读取RNA含量、0D260值、0D260/0D280、蛋白质 含量，0D260/0D280比值为1.8 2.0的RNA保留，备用；(4) 逆转录反应将上述提取的RNA用30ul焦碳酸二乙酯处理灭菌，用蒸馏水溶解，进 行逆转录反应，用随机引物法合成互补DNA;(5) 标准品的制备以互补DNA为模板，加入引物对，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增， 其中使用的引物对是5' -CAACCACCCTCTGTGGACTT-3'和5' -TGTAAACCGGATAGCCAAGG-3';5' -CGTGTTCAACGCTCTCAAAA-3'和5' -CAAGTCCACAGAGGGTGGTT-3';5' -GTGGCCTACCTGTCCAAAM-3'和5' -GAAGCAGAGCCTGGTAGTGG-3';5' -CTGGAAGCCCTCCTCTTCTT-3'和5' -AAGTAAGCCCTGGGTCCTGT-3';上述引物依次如SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8所将扩增完毕的PCR产物进行l. 5%的5XTris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶电 泳，将PCR产物切下，采用PCR产物纯化柱提取纯化PCR产物，用紫外分光光 度法计测260nm处的吸光度值的值(A26Q)，计算每ml PCR产物的拷贝数，公 式为拷贝数/ ml = 6.02 X 1023 X C X A26。 / MW"其中C = 5X10—5 / ml, 匿1= PCR产物的分子量二碱基数X 6. 58 X 102 ，用无菌超纯水将PCR产物 调整至每ml 1.0X1(T拷贝，得标准品，置-20'C保存，备用；(6)实时荧光定量聚合酶连式反应(Real-time PCR)检测反应总体积为25n 1，反应体系含10倍系列稀释的标准品的互补DNA或以 同法制备的样品的互补DNA2u 1，浓度为20pmol/u l的每种引物各ly 1， Power SYBR GREEN12, 5ul，用灭菌双蒸水补足到25 u 1; Real-time PCR反 应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为95"C预变性10min; 95°C， 15s 变性；60°C， 60s退火与延伸，扩增40个循环，在每个循环的第二步结束时进行荧光检测，分别得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值；(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测Ｆｒｉｅｎｄ鼠白血病病毒载量的标准品，是用引物对逆转录扩增获得核酸片段，其特征在于所述病毒基因序列的引物对分别是： ５′－ＣＡＡＣＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧＡＣＴＴ－３′和５′－ＴＧＴＡＡＡＣＣＧＧＡＴＡＧＣＣＡＡＧＧ－３′ ； ５′－ＣＧＴＧＴＴＣＡＡＣＧＣＴＣＴＣＡＡＡＡ－３′和５′－ＣＡＡＧＴＣＣＡＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＴＴ－３′； ５′－ＧＴＧＧＣＣＴＡＣＣＴＧＴＣＣＡＡＡＡＡ－３′和５′－ＧＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧ－３′； ５′－ＣＴＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴ－３′和５′－ＡＡＧＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴ－３′； 上述引物依次如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：崔晓兰，时宇静，郭姗姗，
申请(专利权)人：崔晓兰，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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