直接的mRNA富集定量方法技术

本发明专利技术公开一种生物工程技术领域的直接的ｍＲＮＡ富集定量方法，不需要进行ＲＮＡ抽提，在待检测的菌体或组织破碎后，利用特异性的核酸探针液相杂交保护特异性的ｍＲＮＡ部分片段后，用Ｓ１和ＲＮＡｓｅ酶切除去单链ＤＮＡ，未保护的ＲＮＡ，过量的探针和错配的杂交体，完全配对的ｍＲＮＡ片段经生物素－链亲和素交互作用被磁珠富集后，用双链结合染料直接线性放大定量。本发明专利技术不需要进行ＲＮＡ抽提，快速简便，易于自动化，特异性强，在常规的实验条件下即可完成对ＲＮＡ的定量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物工程
的方法，具体是一种直接的mRNA富 集定量方法。
技术介绍
RNA在生物遗传信息的传递上起着重要作用。目前，有许多基于首先进行 RNA抽提，然后间接进行mRNA定量方法，例如northern印迹、实时定量RT -PCR检测和DNA芯片等。在现有常规方案中，虽然northern印迹分析可用于量 化多目标基因，但是其灵敏度较低，杂交需要大量的总RNA且检测周期长。经对现有技术的文献检索发现，经典的mRNA定量法是实时定量RT - PCR (Bustin等 Quantitative real-time RT-PCR—a perspective, Journal of Molecular Endocrinology (分子内分泌学杂志)2005年34巻597-601页)。 该法的特征在于先提取RNA，然后将mRNA反转录成cDNA，再PCR扩增定量。 需要至少1个小时的反转录及两个小时PCR扩增，总检测时间太长；存在反转 录酶非线性转录，Taq酶非线性放大的倾向，RNA模板易降解，很难自动化等难 题。微阵列芯片技术，可同时进行数以千计的基因表达水平的分析，但是由于 杂交条件非特异而灵敏度相对较低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种直接的mRNA富集定量方 法，不需要进行RNA抽提，快速简便，易于自动化，特异性强，在常规的实验 条件下即可完成对RNA的定量检测，可以迅速直接地监测的mRNA水平的变化。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术不需要进行RNA抽提，在待检 测的菌体或组织破碎后，利用特异性的核酸探针液相杂交保护特异性的mRNA部 分片段后，用SI和RNAse酶切除去单链DNA，未保护的RNA,过量的探针和错 配的杂交体，完全配对的mRNA片段经生物素-链亲和素交互作用被磁珠富集后， 用双链结合染料直接线性放大定量。本专利技术包括如下步骤-第一步，探针设计利用待检测的mRNA序列设计和合成互补的DNA或RNA 探针，5'端或3'端用生物素标记；所指的待检测的mRNA包括各种生物体基因经转录产生的核酸产物，包括 t腿，micro腿或s腿等。第二步，保护杂交待检测的菌体或组织样品在缓冲液中经破碎后，用设 计的探针进行杂交，同时保护待检测的mRNA部分片段。所述的待检测的菌体或组织样品包括细菌、真菌、植物组织、动物组织等。所述的缓冲液包括各种杂交缓冲液。第三步，用Sl和RNAse酶切除去单链DNA、未保护的RNA、过量的探针、 错配的杂交体，留下完全配对的，带生物素标记的探针和mRNA杂交体。第四步，用链亲和素包被的磁珠富集带生物素标记的探针和mRNA杂交体， 同时去除各种细胞碎片、蛋白等杂质。所述的链亲和素包被的磁珠是指用链亲和素经物化处理包被的磁性材料， 包括纳米磁性材料。第五步，用双链结合染料直接定量mRNA。所述的双链结合染料包括各种能与RNA/RNA， DNA/RNA杂交体结合或附着的 染料。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点1)可以迅速直接地监测的mRNA 水平的变化，不需要进行RNA抽提；2)结果稳定，可重复性好。避免了 RNA 降解，非线性反转录，非线性PCR扩增带来的偏差。3)方法简单，易于自动化。本专利技术实施例所使用的荧光假单胞菌M18，已在中国专利局指定的保藏单 位北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC NO. 0462，保藏时间2000.6.27。附图说明图l为本专利技术方法的流程图。 具体实施例方式下面对本专利技术的实施例作详细说明本实施例在以本专利技术技术方案为前提 下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。如以下实施例按照如图1所示的流程进行实施。 实施例1 定量phzC基因的mRNA水平第一步，根据GenBank中phzC基因序列(EF491207)， 用Oligo 6. 0设计 特异性DNA探针。探针序列为5， -biotin- GACAGCTCGTAGTCGAGCAGCAG CATCTCGTGGCTGGTCCAGACCGGCGAGGCATTCGC 。5' 端用生物素标记。利用 Pseudomonas aeruginosa PAOl (AE004091)的基因组序列进行BLAST分析其特 异性。第二步，lmL King' s B培养基液体培养的荧光假单胞菌M18发酵液经8， 000 rpm离心收集菌体。用液氮冻存于-70。 C冰箱。为了避免RNA降解，冻存 菌体需尽快使用。2 mL杂交缓冲液(1XSSC: 4.385 g/L NaCl ， 2.205 g/L trisodium citrate dehydrate, pH 7. 2)和20 ML 2 MM的设计探针同时添加 到冻存的菌体(探针需在菌体化冻之前加入以保护检测mRNA不被RNAse降解)。 在冰浴中用超声细胞破碎机进行菌体细胞破碎。94 ° C变性10min后，32 ° C 温育2小时。第三步，加入1000US1酶(Promega， USA) ， lOPgRNase酶(上海生工) 和1 mL SI酶缓冲液。42 ° C温育4小时。酶和酶缓冲液加入量可调整，酶加 入量多，酶解时间可縮短，酶加入量少，酶解时间需延长。第四步，所有溶液转入装有链亲和素包被的磁珠(Promega， USA)(使用 前用lmL 1XSSC清洗三次)的离心管中。若溶液体积大于离心管体积，可分次 加入。轻轻混匀10分钟后，利用磁铁，用IXSSC清洗磁珠三次。第五步，最后用94叱IX SSC重悬磁珠，加入6 SYBR Green I (捷 瑞生物工程(上海)有限公司)，用荧光测定仪(Fluoroskan Ascent FL， Thermo Fisher Scientific Inc. USA)，在485 nm和527 nm波长下进行荧光强度定 量。测定结果为1. 115。因为一个链亲和素分子可高度亲和结合4个生物素分子， 若需提高测定值，可增加检测样品量，不过酶解时间需延长。实施例2 定量gacA基因的mRNA水平第一步，根据GenBank中gacA基因序列(NC—002516)， 用Oligo 6. 0设计特异性DNA探针。探针序列为5， -biotin-AGTTCCAGCACCATCAGTGGCAGACGC TTCTCCTAGGCAAGGGGTGGGCGGAGTACGTC。 5 ， 端用生物素标记。利用Pseudomonas aeruginosa PAOl (AE004091)的基因组序列进行BLAST分析其特异性。第二步，lmL King' s B培养基液体培养的荧光假单胞菌M18发酵液经8， 000 rpm离心收集菌体。用液氮冻存于-70。 C冰箱。为了避免RNA降解，冻存 菌体需尽快使用。2 mL杂交缓冲液(1XSSC: 4.385 g/L NaCl， 2.205 g/L trisodium citrate dehydrate, pH 7. 2)和20 ML 2幽的设计探针同时添加 到冻存的菌体(探针需在菌体化冻之前加入以保护检测mRNA不被RNAse降解)。 在冰浴中用超声细胞破碎机进行菌体细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种直接的ｍＲＮＡ富集定量方法，其特征在于，包括如下步骤：　第一步，探针设计：利用待检测的ｍＲＮＡ序列设计和合成互补的ＤＮＡ或ＲＮＡ探针，５’端或３’端用生物素标记；　第二步，保护杂交：待检测的菌体或组织样品在缓冲液中经破碎后，用设计的探针进行杂交，同时保护待检测的ｍＲＮＡ部分片段；　第三步，用Ｓ１和ＲＮＡｓｅ酶切除去单链ＤＮＡ、未保护的ＲＮＡ、过量的探针、错配的杂交体，留下完全配对的，带生物素标记的探针和ｍＲＮＡ杂交体；　第四步，用链亲和素包被的磁珠富集带生物素标记的探针和ｍＲＮＡ杂交体，同时去除各种细胞碎片、蛋白杂质；　第五步，用双链结合染料直接定量ｍＲＮＡ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董德贤，任慧娟，朱红亮，许煜泉，李荣秀，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]