苹果S基因型快速鉴定方法及其专用试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种苹果Ｓ基因型的鉴定方法及其专用试剂盒。该方法，是以待检测苹果品种的基因组ＤＮＡ为模板，用鉴定苹果品种Ｓ基因型的引物对扩增，根据扩增结果确定该待测苹果品种的Ｓ基因型。该方法可快速鉴定苹果自交不亲和品种Ｓ基因型，通过其Ｓ基因型筛选授粉树，对苹果种植及杂交研究具有重大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种苹果s基因型的快速鉴定方法及其专用试剂盒与其在筛选苹果授粉品种中的应用。
技术介绍
苹果属于配子体型自交不亲和性类型,受单一位点的复等位基因控制，这一位点又称为S位点，位于苹果基因组的第17对染色体上，在一个S位点上苹果种群内含 有多个S等位基因。S位点包括花柱S基因(S-RNase基因)和花粉S基因(F-box 基因)，自花或者异花授粉时，花粉的S等位基因与花柱中两个S等位基因之一相 同时，花粉管在花柱中的生长会受到抑制，从而无法完成受精而表现出自交不亲和性 (Kao T H， Tsukamoto T. The molecular and genetic bases of S-RNase-based self-incompatibility. Plant Cell, 2004， 16:S72陽S83)。苹果品种的S基因型即为自交不 亲和基因型，表示各个苹果品种体内的包含的S基因信息。绝大多数苹果品种表现自 交不亲和性，但并不是所有的苹果品种之间授粉都是亲和的，S基因型相同的两个品种之间相互授粉表现不亲和性，称异交不亲和性。因此，提早预知苹果品种的s基因型,对于生产上合理配置授粉树,减少因授粉品种选择不利造成的损失，以及在选配育 种亲本，鉴定同名异物和异物同名的苹果品种等方面具有重要的意义。Lewis (1952)利用血清免疫学方法从配子体自交不亲和的月见草(Oe""&era wg朋M^)中发现了与S特定位点等位基因相关的蛋白质。此后，从茄科等植物中发 现含量丰富并与S位点遗传连锁的花柱糖蛋白。目前为止，已从茄科、蔷薇科、玄参 科等多种植物中分离出大量S-RNase基因。根据DNA序列的分析比较，发现其编码 的蛋白产物与真菌的RNaseRH和RNaseT2具有同源性，含相同的活性部位，并具 有核酸酶活性，故称为S-核酸酶(S-RNase)。目前已有的证据有力证明了 S-RNase 就是S-基因在花柱中的产物，即花柱S-决定子。S-RNase为一类分泌型糖蛋白，它在 雌蕊中特异表达，活体情况下S-RNase在自交后表现酶的活性。 一般认为自交不亲 和是由于自交后花柱中的S-RNase进入花粉管，作为细胞毒素使自己的花粉管RNA 降解，细胞溶解，导致花粉管生长抑制，表现自交不亲和。近年来越来越多的苹果的 S-RNase基因被鉴定和克隆，苹果花柱的S-RNase核苷酸结构具有明显的5个保守区 (Cl、 C2、 C3、 RC4禾卩C5)和2个高变区(HVa禾BHVb)，其位于高变区(HVa) 内的内含子长度具有多态性，可以根据它的这些特点利用PCR来鉴定苹果品种的S基因型。苹果作为配子体型自交不亲和性果树,有众多学者开展其自交不亲和性机理的研 究,就品种自交不亲和性基因型的鉴定而言,迄今已鉴定出了30多个S等位基因，但是它们存在命名混乱及重复现象，有关学者经过对这些s等位基因进行测序比对,重新整理和总结和命名了23个苹果S基因(S!、 S2、 S3、 S4、 S5、 S6、 S7、 S8、 S9、 S1()、Sll、 S!5、 Si6、 Si8、 S19、 S20、 S21、 S22、 S23、 S24、 S26、 S31禾口S32)。大多数苹果品种为二倍体，含有两个s等位基因，也有部分品种为三倍体含有三个s等位基因，也 有个别单倍体苹果品种，只含有一个s等位基因。人们最早是利用田间杂交和自交座果率高低的方法来判断苹果品种的s基因型的。该方法的优点是直观而且易操作，但其也明显存在工作量大、鉴定周期长(必须苹果品种开花之后)、效率低等不足之处，特别是当双亲或一个亲本的s基因型未知 或没有适当的测试品种时，就无法确定品种的s基因型。之后的研究发现，苹果的s基因在花柱中编码产物是糖蛋白，具有RNase活性，可以根据花柱S糖蛋白电泳分析 法来确定S基因型，但由于其操作过程较复杂，特别是等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳 的操作技术要求较高，而且试验条件不太一致，各S-RNase的PI值可能会有偏差， 另外，所用试材是成龄树的花柱，使取材受限制，而且需要试材量大，尤其研究杂种 群体时，需要等待杂种个体渡过童期。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种苹果S基因型的快速鉴定方法及其专用试剂盒与它们 的应用。本专利技术所提供的鉴定苹果S基因型的专用试剂盒，包括下述(1) - (16)所示的 引物对(1) 扩增S!基因的引物对序列为序列表中序列1的核苷酸片段和序列为序列 表中序列2的核苷酸片段组成的引物对；(2) 扩增S2基因的引物对序列为序列表中序列3的核苷酸片段和序列为序列 表中序列4的核苷酸片段组成的引物对；(3) 扩增S3基因的引物对序列为序列表中序列5的核苷酸片段和序列为序列 表中序列6的核苷酸片段组成的引物对；(4) 扩增S4基因的引物对序列为序列表中序列7的核苷酸片段和序列为序列 表中序列8的核苷酸片段组成的引物对；(5) 扩增S5基因的引物对序列为序列表中序列9的核苷酸片段和序列为序列 表中序列10的核苷酸片段组成的引物对；(6) 扩增S7基因的引物对序列为序列表中序列11的核苷酸片段和序列为序 列表中序列12的核苷酸片段组成的引物对；(7) 扩增S9基因的引物对序列为序列表中序列13的核苷酸片段和序列为序 列表中序列14的核苷酸片段组成的引物对；(8) 扩增Sh)基因的引物対序列为序列表中序列15的核苷酸片段和序列为序 列表中序列16的核苷酸片段组成的引物对；(9) 扩增Sn基因的引物对序列为序列表中序列17的核苷酸片段和序列为序 列表中序列18的核苷酸片段组成的引物对；(10) 扩增S^基因的引物对序列为序列表中序列19的核苷酸片段和序列为 序列表中序列20的核苷酸片段组成的引物对；(11) 扩增S2o基因的引物对序列为序列表中序列21的核苷酸片段和序列为 序列表中序列22的核苷酸片段组成的引物对；(12) 扩增S2i基因的引物对序列为序列表中序列23的核苷酸片段和序列为 序列表中序列24的核苷酸片段组成的引物对；(13) 扩增S23基因的引物对序列为序列表中序列25的核苷酸片段和序列为 序列表中序列26的核苷酸片段组成的引物对；(14) 扩增S24基因的引物对序列为序列表中序列27的核苷酸片段和序列为序列表中序列28的核苷酸片段组成的引物对；(15) 扩增S26基因的引物对序列为序列表中序列29的核苷酸片段和序列为 序列表中序列30的核苷酸片段组成的引物对；(16) 扩增S^基因的引物对序列为序列表中序列31的核苷酸片段和序列为序列表中序列32的核苷酸片段组成的引物对。上述引物分别以溶液形式保存，浓度为10pM—100pM;优选为10pM;为了确保PCR反应不受盐等杂质的干扰，引物溶剂采用灭菌的超纯水。各引物分别保存于 一个离心管中，共32管，将这些离心管集中放置于一个试剂盒中，方便随时取用。上述(1) - (16)所示每个S基因的一对引物优选为分别以上下游引物相同的 浓度混合置于同一试剂容器中，以便PCR反应过程中，上下游引物可以于一次取用， 节省PCR体系配制的程序。上述试剂盒中配有灭菌的超纯水、dNTP (10mM) 、 10xT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定苹果Ｓ基因型的专用试剂盒，包括（１）－（１６）所示的引物对：　（１）扩增Ｓ↓［１］基因的引物对：序列为序列表中序列１的核苷酸片段和序列为序列表中序列２的核苷酸片段组成的引物对；　（２）扩增Ｓ↓［２］基因的引物对：序列为序列表中序列３的核苷酸片段和序列为序列表中序列４的核苷酸片段组成的引物对；　（３）扩增Ｓ↓［３］基因的引物对：序列为序列表中序列５的核苷酸片段和序列为序列表中序列６的核苷酸片段组成的引物对；　（４）扩增Ｓ↓［４］基因的引物对：序列为序列表中序列７的核苷酸片段和序列为序列表中序列８的核苷酸片段组成的引物对；　（５）扩增Ｓ↓［５］基因的引物对：序列为序列表中序列９的核苷酸片段和序列为序列表中序列１０的核苷酸片段组成的引物对；　（６）扩增Ｓ↓［７］基因的引物对：序列为序列表中序列１１的核苷酸片段和序列为序列表中序列１２的核苷酸片段组成的引物对；　（７）扩增Ｓ↓［９］基因的引物对：序列为序列表中序列１３的核苷酸片段和序列为序列表中序列１４的核苷酸片段组成的引物对；　（８）扩增Ｓ↓［１０］基因的引物对：序列为序列表中序列１５的核苷酸片段和序列为序列表中序列１６的核苷酸片段组成的引物对；　（９）扩增Ｓ↓［１１］基因的引物对：序列为序列表中序列１７的核苷酸片段和序列为序列表中序列１８的核苷酸片段组成的引物对；　（１０）扩增Ｓ↓［１９］基因的引物对：序列为序列表中序列１９的核苷酸片段和序列为序列表中序列２０的核苷酸片段组成的引物对；　（１１）扩增Ｓ↓［２０］基因的引物对：序列为序列表中序列２１的核苷酸片段和序列为序列表中序列２２的核苷酸片段组成的引物对；　（１２）扩增Ｓ↓［２１］基因的引物对：序列为序列表中序列２３的核苷酸片段和序列为序列表中序列２４的核苷酸片段组成的引物对；　（１３）扩增Ｓ↓［２３］基因的引物对：序列为序列表中序列２５的核苷酸片段和序列为序列表中序列２６的核苷酸片段组成的引物对；　（１４）扩增Ｓ↓［２４］基因的引物对：序列为序列表中序列２７的核苷酸片段和序列为序列表中序列２８的核苷酸片段组成的引物对；　（１５）扩增Ｓ↓［２６］基因的引物对：序列为序列表中序列２９的核苷酸片段和序列为序列表中序列３０的核苷酸片段组成的引物对；　（１６）扩增Ｓ↓［３１］基因的引物对：序列为序列表中序列３１的核苷酸片段和序列为序列表中序列３２的核苷酸片段组成的引物对。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李天忠，龙慎山，韩振海，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]