桃属植物的种的鉴别方法技术

本发明专利技术涉及提供高准确度确定桃属植物的种的方法。具体而言，涉及鉴别待检样品中所含桃属植物的种的方法。该方法包括待检样品中所含植物的叶绿体基因组中核糖体基因ｒｐ１１６的内含子部分区域的碱基序列，与选自序列号１－７的至少一种碱基序列进行比较。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及通过基因工程学方法鉴别桃属(只属)植物的种的方法。杏仁(《3々-> )是日本药局方中第14局第1增补收 载由々,k乂杏(/Vwwws anwew/aca Lirme )及野杏(armew/aca Lirme var. ansu Maximowicz )作为其基原植物的生药。但在中国，除此之夕卜， 有*山杏(/Vwww51 w'^7"/ca Linne )或东；)匕杏(iVwwws m""(^Awn'ca )的 生药流通。另一方面，桃仁(卜々-^ )在日本药局方中，与杏仁同 才羊i也,是以冲兆属的杉匕(尸n/w^ / e^^'ca Batsch )和山杉匕(iVwwws Batsch var. davidiana Maximowicz )作为其基原植物的生药。但在中国， 除此之外，还有含光核桃(尸n/m^m/ra)的生药流通。但是，很难鉴 别是仅含基原植物的真正生药，还是也含有除基原植物之外的植物的 生药。因此，杏仁和桃仁的汉方制剂存在质量的安全性问题。近年随着分子遗传学的发展，对生物分类学方法论带来很 大的影响。也就是说，除了现有的形态学分类以外，选择某一特定基 因，在生物种间比较其碱基序列，可以通过其基因的相似性推测其进 化过程，对其进行分类。对于生物种造成的基因差异程度， 一方面，以惊人的程度 保存了编码维持基本生命活动的蛋白质的基因，另一方面，多数基因 又因为每个蛋白质功能的发散而发生变化，很难判断是否同一起源。 因此，针对分类对象的生物种的范围选择适合的基因领域可以对，例 如，象鲸与其它哺乳类间的关系那样较广范围内的近缘关系进行分 类，也可以在如乌鸦的地域差异那样的有限范围内进行详细分类。这 种最常用于推定进化上的相对距离的、分类中最常用的基因已报导的 有核糖体RNA基因(非专利文献l)、线粒体基因(非专利文献2)、 叶绿体核糖体基因内含子区域的碱基序列(非专利文献3)等多个基 因。 但是，对于桃属植物的多个种，尚没有测定其碱基序列、 进行分类，因此尚无据此进行种的判断的例子。Bruce Alberts et al., Essential Cell Biology, Garland Publishing Inc., 439-440, 1998宝来聰、細胞工学、14巻、1031~ 1035、 1995The Journal of Phytogeography and Taxonomy 48: 63-66, 2000本专利技术的课题是提供以高准确度鉴别桃属植物的种的方法。本专利技术者们对上述课题进行了研究，结果发现在桃属植物 的叶绿体核糖体基因rpl 16的内含子区域存在种特异的多型性，并且， 利用该多型性能鉴别桃属植物的种，从而完成了本专利技术。也就是说，本专利技术包括以下专利技术(1) 一种鉴别待检样品中所含的桃属植物的种的方法，它包括 将待检样品中所含的植物的叶绿体基因组中核糖体基因rpl16的内含 子的部分区域的碱基序列，与选自序列号1-7的至少一种碱基序列 进行比较。(2) (l)的方法，其中核糖体基因rpl16内含子的部分区域是 指用由序列号8的碱基序列构成的引物与由序列号9的碱基序列构成 的引物组成的引物对进行扩增的区域。(3) (2)的方法，其中待检样品是生药。(4) (1) ~ (3)任一项的方法，其中待检样品中所含的桃属 植物是指鉴别为山桃、桃、光核桃、杏、山杏及东北杏的任一种植物。(5) (1) ~ (4)任一项的方法，以序列号1的碱基序列作为 参照序列时，通过对相当于选自其第5位、6位、41位、84位、85 位、86位、87位、88位、89位、90位、94位、118位、119位、120 位、121位、122 4立、123位、124位、125位、126位、127 4立、130 位、153位、206位、207位、208位、209位、210位、211位、212 位、213位和246位碱基中的至少一个碱基进行比较。本专利技术提供以高准确度鉴别桃属植物的种的方法。高等植物的细胞内具有进行光合作用的叶绿体，这些植物包含核基因组和独立的叶绿体基因组。叶绿体基因组中核糖体基因rpl16的内含子(以下，称作rpl16内含子)的部分区域由约1100个 碱基构成，是叶绿体基因组DNA内编码核糖体蛋白质的基因rpl 16中， 分隔编码氨基酸序列的外显子的非编码区域中222-240碱基的部分区 域。更具体而言，是与烟草(Mco"a"a /a6acwm)中的已知叶绿体基 因组全碱基序列(Z00044)的84143位~ 84418位同源的区域，以 5'-AATTAAAAAA或5'陽AATTTTAAAA开始的区域。换言之，本专利技术中作为比较对象的rpl16内含子的部分区 域，是以叶绿体基因组DNA为模板，用由序列号8的碱基序列构成 的引物与由序列号9的碱基序列构成的引物组成的引物对进行扩增的 区域。也可使用其它的引物对，只要其能扩增出与由序列号8的碱基 序列构成的引物和由序列号9的碱基序列构成的引物组成的引物对扩 增出的区域等同的区域即可，这样的区域也包含在本专利技术的rpl16内 含子的部分区域中。叶绿体基因组中的非编码区域在细胞内含有多个拷贝，个 体内均一，所以容易分析。但由于比较迅速的进化速度，所以也有报 导种间存在差异的植物群存在。作为*匕属才直物，可歹寸举，例如山杉匕(iV"ww (/aWA'awa )、 杉匕(尸n/ww pens7'ca )、光核书匕(尸n^2W51 mz'ra )、杏(尸rawj^ )、山杏(尸n/w^s 5777z力'cfl )及东北杏(尸nmws waw^y/mn,ca )等。本专利技术者们应用日本药局方中作为生药杏仁的基原植物 记载的杏及分布在中国的其它2种桃属植物，即山杏或东北杏，以及 作为生药桃仁的基原植物记载的桃及山桃以及分布在中国的其它桃 属植物，即光核桃(尸n/m^附/ra )共计6种植物的多个样品确定rpl16 内含子的部分区域，特别是用由序列号8的碱基序列构成的引物与由 序列号9的碱基序列构成的引物组成的引物对扩增出的区域的碱基序 列进行对比，结果发现桃属植物的rpl16内含子的碱基序列上存在种 特异的多型性。也就是说，他们发现通过将待检样品中所含植物的rpl16内含子部分区域的碱基序列与选自序列号1~7的至少一种碱基序列 进行比较，可鉴别出桃属植物的种。序列号1和2表示山桃rpl16内 含子部分区域的碱基序列，序列号3表示桃rp116内含子部分区域的 碱基序列，序列号4表示光核桃rpl16内含子部分区域的碱基序列， 序列号5表示杏rpl16内含子部分区域的碱基序列，序列号6表示山 杏rpl16内含子部分区域的碱基序列，序列号7表示东北杏rp116内含 子部分区域的碱基序列。根据本专利技术的方法，至少可鉴别出上述6种桃属植物的种。 本专利技术的方法，对杏、桃及山桃这3种的鉴别特别有用。本专利技术中鉴别桃属植物的种，包括鉴别出是特定的种，鉴 别出不是特定的种，鉴别为包含于特定的种的群以及鉴别为不包含于 特定种的群。例如， 一个实施方案中，本专利技术的方法可鉴别待检样品中 所含桃属植物是否是日本药局方中作为杏仁的基原植物记载的杏或 是其以外的种。换言之，可以鉴别待检样品是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别待检样品中所含的桃属植物的种的方法，它包括将待检样品中所含植物的叶绿体基因组中核糖体基因ｒｐ１１６内含子部分区域的碱基序列，与选自序列号１～７的至少一种碱基序列进行比较。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：山路弘树，
申请(专利权)人：株式会社津村，
类型：发明
国别省市：JP[日本]