粮食作物深加工制品高通量五重巢式PCR转基因检测方法技术

本发明专利技术公开一种粮食作物深加工制品五重巢式ＰＣＲ转基因检测方法，其检测方法为：１．ＤＮＡ提取和浓度检测；２．引物设计；３．第一、二轮五重巢式ＰＣＲ反应体系及反应条件；４．扩增产物检测；５．结果判定。本发明专利技术技术具有高通量、快捷、准确、灵敏、经济的诸多优点，不仅可以用来检测转基因大豆、玉米和水稻的单一深加工制品，还可以检测转基因大豆、玉米和水稻的混合深加工制品。本发明专利技术提高了检测效率、减少了检测时间和检测成本，并可以有效减少假阳性的结果，因此，可以应用于对主要粮食作物如大豆、玉米和水稻豆油等转基因深加工食品进行ＤＮＡ检测，具有实际意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是一种用于主要粮食作物深加工产品高通量转基因检测方法.(二) 技术背景随着各国有关转基因生物(genetically modified organism, GMO) 标签法的建立和不断 完善，转基因成分的准确检测也显得日趋重要，很多国家不但要求对转基因产品进行定性检 测，还需要对产品中的GMO含量进行定量检测，以便标识。欧盟等国家和地区先后出台转 基因产品的标签制度，出入境产品必须出具是否含有转基因成分的检测报告。近年来，我国 大量进口转基因大豆用于加工，由于市场标识不够,使我国加工产品出口贸易遭受损失。为了 加强对农业转基因生物的安全管理，保障人体健康，规范转基因产品的销售行为，引导和保 护消费者的知情权，农业部颁布了《农业转基因生物标识管理办法》，该办法规定了在中国 境内需要标识的第一批转基因生物及其产品，即大豆、玉米、油菜、棉花和番茄等5类17种 产品。目前国内的相关标准较为混乱，出现了一些技术标准不一致、法规滞后、与国际惯例 不接轨等现象，致使某些产品实行国际、国内市场"双重标准"，没有依照中国有关转基因食 品的规定贴上相关标识，侵害了中国消费者的利益。大豆、玉米和水稻深加工制品己越来越多，如卵磷脂、大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴 儿米粉、大豆油、玉米油、玉米蛋白质粉、玉米淀粉、麦片等食品，其加工呈现复杂化和多 元化的特点，在国内外仍然没有适合的标准依据进行检测。"乐之事件"以及"雀巢食品含转基 因"事件都表明，我国在转基因市场的管理上确实存在漏洞，对转基因食品的监督力度不足， 造成了企业有法律空子可钻。要完善、健全我国的转基因产品管理制度，首要问题是要解决 我国尚未统一的检测标准问题，同时要提高转基因检测的精确度，以保证我国消费者的利益。目前，欧盟率先倡导并实行转基因标识并要求产品成分中转基因含量大于1%时必须进 行标识，因此其检测技术早己经成熟，检测下限达0.1% 。国内一些机构，尤其进出口检疫 局也相继建立检测实验室，技术趋于成熟，但还只限于对转基因原料的检测，在深加工产品 的检测技术的研究上还很不成熟，没有统一的检测标准，检测结果不稳定。深加工产品转基 因检测所需的DNA提取技术在国外尚处于研究阶段，并没有形成系列化技术，商品化的提 取试剂盒种类单一。由于深加工产品种类繁多，生产工艺复杂，而深加工品DNA提取技术 应该是一系列技术，提取试剂盒也应该是多样化，不同产品采用不同试剂盒，缺乏针对不同 深加工转基因产品的DNA提取技术。因此，急需建立了一整套简便、精确、快捷、成熟、 可信度高的转基因粮食作物深加工制品检测技术体系，为我国粮食作物转基因产品检测标准化提供技术平台，为GMO标签制度进一步发展提供技术保证。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种有效地防止假阴性结果的出现，而且可以提高检测效率、縮短检测周期，具有高效、快速、低成本、高灵敏度的粮食作物深加工制品高通量五重巢式PCR 转基因检测方法。本专利技术的目的是这样实现的检测方法的检测过程为 材料阳性标准品转基因大豆、玉米、水稻； 阴性标准品非转基因大豆、玉米、水稻；待检样品深加工产品大豆蛋白质粉、巧克力饮品、婴儿米粉、大豆卵磷脂、大豆油、 大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、营养麦片、玉米泥；试剂Wizard Magnetic DNA Purification System for Food试剂盒；r-Taq DNA聚合酶、 dNTP、 10xPCR缓冲液(含MgCl2)和DL DNA2000分子质量标准。(1) DNA提取(1.1) DNA提取将大豆、玉米、水稻标准品粉末及其它待检样品根据Wizard艮Magnetic DNA Purification System for Food试剂盒操作说明分别进行DNA提取。(1.2) DNA样品浓度检测DNA浓度通过核酸蛋白分析仪和电泳-EB染色的荧光强度双重测定。(2) 引物设计利用Primer Premier V5.0软件进行五重巢式PCR的引物设计，用Oligo V6.22软件筛选 出引物之间互相干扰最小的引物。引物所扩增目的片段及扩增产物大小如下表。表1多重巢式PCR所用引物序列及扩增片段大小 Tab. List of primers in multiple nested PCR<table>table see original document page 6</column></row><table>PCR引物AATCTTCTACTGGTACATGGAThe primer of the firstRbcl WF Rbcl WRC TCATCATCTTTGGTAAAATCARBCL433multipleAGPCRGGACAACAACCCAAACATCACry WF Cry WRAC TTGGTACAGGTTGCTCAGGC CCTCCrylA(B)322BarWF BarWRGTCTGCACCATCGTCAACC ACTCGGCCGTCCAGTCGTABAR201Pat WF Pat WRAGATTAGGCCAGCTACAGCA GC GCAACCAACCAAGGGTATCPAT160AATCTTCTACTGGTACATGGARbcl NF Rbcl NRC GACCGTACTTGTTCAACTTATRBCL321第一轮多CC重 PCR引物CP4NF CP4NRGGCGACGCCTCGCTCACAA GCGTCATGATCGGCTCGATGCP4-EPSPS240The primer of theBarNF BarNRACAAGCACGGTCAACTTCC ACTCGGCCGTCCAGTCGTABARH5second multipleCryNF Cry NRGGACAACAACCCAAACATCA ACCrylA(B)152PCRGCACGAACTCGCTGAGCAGPatNF PatNRAGATTAGGCCAGCTACAGCA GC ACTCTTGTGGTGTTTGTGGCPAT100(3)五重巢式PCR反应体系(3.1) 第一轮五重PCR反应体系及反应条件在第一轮五重PCR反应体系中，加DNA模板(500ng) ， dNTP各0.2mmol/L， 2xPCR 缓冲液，引物混合液I 10pL， DNA聚合酶4U，补水至50nL。扩增条件为95'C预变性10min， IO个循环(95°C， 30sec; 65°C， 60s; 72°C， 60s) ; IO个循环(95。C， 30sec; 62°C， 60s; 72°C， 60s) ; IO个循环(95°C， 30sec; 60°C， 60s; 72°C， 60s) ; 10个循环(95°C， 30sec; 58°C， 60s; 72°C， 60s);最后72。C延伸lOmin。(3.2) 第二轮五重PCR反应体系及反应条件 取第一轮五重PCR产物lpL作为模板，进行五重巢式PCR第二轮扩增。反应体系加引物混合液ni0^iL， DNA聚合酶3U，其余同前。扩增条件同第一轮反应条件。(4) 扩增产物检测两轮扩增产物用琼脂糖电泳检测。琼脂糖胶浓度为3%，胶中溴本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种粮食作物深加工制品高通量五重巢式ＰＣＲ转基因检测方法，其特征在于其检测方法为：　材料：　阳性标准品：转基因大豆、玉米、水稻；　阴性标准品：非转基因大豆、玉米、水稻；　待检样品：深加工产品大豆蛋白质粉、巧克力饮品、 婴儿米粉、大豆卵磷脂、大豆油、大豆色拉油、玉米油、玉米淀粉、玉米蛋白粉、营养麦片、玉米泥；　试剂：Ｗｉｚａｒｄ↑［＊］　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｏｏｄ试剂盒，ｒ－Ｔａｑ　 　ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、１０×ＰＣＲ缓冲液（含ＭｇＣｌ２）和ＤＬ　ＤＮＡ２０００分子质量标准；　（１）ＤＮＡ提取　（１．１）ＤＮＡ提取　将大豆、玉米、水稻标准品粉末及其它待检样品根据Ｗｉｚａｒｄ↑［＊］　Ｍａｇｎｅｔ ｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｆｏｏｄ试剂盒操作说明分别进行ＤＮＡ提取；　（１．２）ＤＮＡ样品浓度检测　ＤＮＡ浓度通过核酸蛋白分析仪和电泳－ＥＢ染色的荧光强度双重测定；　（２）引物 设计　利用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　Ｖ５．０软件进行五重巢式ＰＣＲ的引物设计，用Ｏｌｉｇｏ　Ｖ６．２２软件筛选出引物之间互相干扰最小的引物，引物所扩增目的片段及扩增产物大小如下表：　表　多重巢式ＰＣＲ所用引物序列及扩 增片段大小　＊＊＊　（３）五重巢式ＰＣＲ反应体系　（３．１）第一轮五重ＰＣＲ反应体系及反应条件　在第一轮五重ＰＣＲ反应体系中，加ＤＮＡ模板１μＬ（５００ｎｇ），ｄＮＴＰ各０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，２×ＰＣＲ缓冲液，引物混合 液Ⅰ　１０μＬ，ＤＮＡ聚合酶４Ｕ，补水至５０μＬ，扩增条件为：９５℃预变性１０ｍｉｎ，１０个循环（９５℃，３０ｓｅｃ；６５℃，６０ｓ；７２℃，６０ｓ）；１０个循环（９５℃，３０ｓｅｃ；６２℃，６０ｓ；７２℃，６０ｓ）；１０个循环（９５℃， ３０ｓｅｃ；６０℃，６０ｓ；７２℃，６０ｓ）；１０个循环（９５℃，３０ｓｅｃ；５８℃，６０ｓ；７２℃，６０ｓ）；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ；　（３．２）第二轮五重ＰＣＲ反应体系及反应条件　取第一轮五重ＰＣＲ产物１μＬ作为模板，进行 五重巢式ＰＣＲ第二轮扩增，反应体系加引物混合液Ⅱ　１０μＬ，ＤＮＡ聚合酶３Ｕ，其余同前。扩增条件同第一轮反应条件；　（４）扩增...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：敖金霞，高学军，曲波，李庆章，刘营，袁肖寒，仇有文，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]