空肠弯曲菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了空肠弯曲菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒由ＤＮＡ聚合酶、稳定液、反应液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上五种液体分别置于容器中。本发明专利技术的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性。本发明专利技术的基因快速诊断试剂盒快速、高效、灵敏度高，只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低。本发明专利技术的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从ｄＮＴＰ析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Ｍｇ↑［２＋］结合，产生副产物－焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，更加明显可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测试剂，具体涉及一种空肠弯曲菌基因快速诊 断试剂盒及其检测方法。
技术介绍
目前对空肠弯曲菌有多种检测方法，从以病原微生物分离鉴定、形态学鉴定和自动生化鉴定为主的国家标准(GB/T4789.9—2003)， 到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技 术等分子生物学检测方法。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和 灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、 生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离提纯，而 直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且 与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和 自动化的方向发展。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实 际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要 专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光 实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术 中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快 速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确 性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最 新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等 温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测 技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA，简称LAMP)具有今艮 多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测空肠弯曲菌 的基因快速诊断试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种检测成本 低、使用方便、检测速度快、特异性高的基于环介导等温扩增技术的 空肠弯曲菌基因快速诊断试剂盒。本专利技术的另一个目的是提供上述空肠弯曲菌基因快速诊断试剂 盒的检测方法。本专利技术的上述目的是通过如下技术方案予以实现的一、本专利技术的空肠弯曲菌基因快速诊断试剂盒，是由两对引物、S^DNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上七种液体分别置于容器中，其中 所述的两对引物为外引物F3: GAAGCGCrmTGGTTCTT;外引物B3: GGTATTACTCAAGGTATGATGTG;内引物FIP: GGTGGATTGTTGTATCTTATCGGTTttttTATCAAG C ACTCTTCCACAAG;内引物BIP: ATAAGGAACAATAGCCACAACAGTttttGCGACA GATGAGTATGGTAAC;上述每lL反应液中含有1.6 2mmo1 dNTP 、 20 25mmo1 Tris-HCl、 10 12.5mmol氯化钾、10 12.5mmol硫酸铵、8 10mmo1 硫酸镁、1 1.25ml TritonX-100、 0.8 lmol甜菜碱、内引物FIP/BIP 各1.6 2mol和外引物F3/B3各0.2 0.25mol;优选的比例是每1L反应 液中含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-HCl、 12.5mmol氯化钾、12.5mmo1 硫酸铵、10mmol硫酸镁、1.25ml TritonX-100、 lmol甜菜碱、内引物 FIP/BIP各2mol和夕卜引物F3/B3各0.25mo1。上述每1L样品预处理液中含有10 20 mmol pH 8.0的Tris-HCl、 1 2 mmol EDTA和10 12ml Triton X-IOO。优选的比例是每1L样品预 处理液中含有20mmo1 Tris-HC1 (pH 8.0)、 2mmo1 EDTA和12ml Triton X-IOO。上述显色液优选为荧光染料SYBR Green I或EvaGreen;上述稳定液优选为石蜡油。上述阳性对照为空肠弯曲菌基因组DNA 。二、本专利技术基因快速诊断试剂盒的生产工艺1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；2、 将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；3、 将稳定液无菌分装，抽样质检；4、 将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；5、 组装试剂盒。三、本专利技术基因快速诊断试剂盒的检测方法1、 样品处理将待测样品按国标(GB/T4789.9 —2003)增菌后，取增菌悬液于 离心管中离心，去上清，沉淀中加入样品预处理液并混合均匀，沸水 浴灭活后冰上冷却，高速离心后，上清即为样品模板DNA;2、 环介导等温扩增技术反应过程在反应管中加入反应液38 40体积％， Bst DNA聚合酶大片段 0.9 1.8体积％，稳定液52 54.5体积％，样品模板DNA4.5 9体 积％， 63 65。C恒温反应45 90min。所述体积百分比是指占四个组 分总体积的体积百分比。3、 反应后处理在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显 色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。本专利技术的原理是利用5" DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的 两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异 性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DN A区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg^结合，产生副产物^^ 磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒 温(63 65°C)条件下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条 件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检 测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检 测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂 和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一 种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与P CR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术 在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技 术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而 且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试 剂盒出售。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结 合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2 3天，完 成鉴定报告需10 15天；采用本专利技术的基因快速诊断试剂盒仅需2 小时。并且，本专利技术的反应液中加入了显色液，鉴定结果更为直观清 晰。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果l.本专利技术的基因快速诊断试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反 应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本专利技术的基因快速诊断 试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本专利技术的基因快速诊断试剂盒扩增 快速且高效，在不到l小本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种空肠弯曲菌基因快速诊断试剂盒，其特征在于由Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上五种液体分别置于容器中，反应液内两对引物为：　外引物Ｆ３：ＧＡＡＧＣＧＣＴＴＴＴＴＧＧＴＴＣＴＴ；　 外引物Ｂ３：ＧＧＴＡＴＴＡＣＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧＡＴＧＴＧ；　内引物ＦＩＰ：ＧＧＴＧＧＡＴＴＧＴＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＧＧＴＴｔｔｔｔＴＡＴＣＡＡＧＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＧ；　内引物ＢＩＰ：ＡＴＡＡＧＧＡＡＣＡＡＴＡＧＣＣＡ ＣＡＡＣＡＧＴｔｔｔｔＧＣＧＡＣＡＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＧＴＡＡＣ；　每１Ｌ反应液中含有１．６～２ｍｍｏｌ　ｄＮＴＰ、２０～２５ｍｍｏｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０～１２．５ｍｍｏｌ氯化钾、１０～１２．５ｍｍｏｌ硫酸铵、８～１０ｍｍｏｌ 硫酸镁、１～１．２５ｍｌ　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．８～１ｍｏｌ甜菜碱、内引物ＦＩＰ／ＢＩＰ各１．６～２ｍｏｌ和外引物Ｆ３／Ｂ３各０．２～０．２５ｍｏｌ；　每１Ｌ样品预处理液中含有１０～２０ｍｍｏｌ　ｐＨ８．０的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ 、１～２ｍｍｏｌ　ＥＤＴＡ和１０～１２ｍｌ　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００；　上述阳性对照为空肠弯曲菌基因组ＤＮＡ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹以诚，李志勇，陈洵，杜正平，王志强，谭惠媚，
申请(专利权)人：广州华峰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]