本发明专利技术涉及一种产单端孢霉烯族毒素真菌环介导等温扩增快速检测方法。其中的试剂包括环介导等温扩增反应液、Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶、显色剂；反应液含有反应缓冲液、ｄＮＴＰ、硫酸镁、上游内引物５－ＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＣＴＴＧＣＡＡＣ－ＣＴＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＣＧＧ－３、下游内引物５－ＴＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＡＧＧ－ＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＧＴＡＧＣＧＡＣＡＧ－３、上游外引物５－ＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＣＴＴＡＴＣＧＣ－３、下游外引物５－ＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＡＧ－３和甜菜碱；检测产单端孢霉烯族毒素真菌的方法包括真菌ＤＮＡ的提取、产单端孢霉烯族毒素真菌的环介导等温扩增、显色检测。本发明专利技术的特点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法， 具体是一种。
技术介绍
单端孢霉烯族毒素是一组类倍半萜烯真菌毒素，它们共同的结构特点是有一 12， 13-环氧单端孢霉烯(印oxytrichothecene)骨架，其上8-酮基的存在或缺乏是 区分B类和A类的依据，存在者是B类，缺乏者是A类。A类相应于8-酮基的位置是颉 草基(valerianyl)、乙酰基或者羟基。再者，C类单端孢霉烯族毒素(巨环单端 孢霉烯族毒素)与上述两类不同的是存在着一个大环内酯圈，附着在单端孢霉烯 族毒素-黏液霉素的4》和15位置。单端孢霉烯族毒素主要由镰孢菌属(^^ar/^;) 的各物种产生，其中最为常见的或从自然界分离出的是B-单端孢霉烯族毒素 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和雪腐镰孢醇(NIV)， A-单端孢霉烯族毒素T-2毒素、 HT-2毒素、新茄病镰刀菌烯醇(NEOS)和蛇形菌素(DAS)。自然界中，低温储藏过冬 的玉米、麦类、小米和高粱等常含有大量的单端孢霉烯族毒素。到目前为止，人 类单端孢霉烯族毒素中毒的主要临床表现为消化系统和神经系统症状，主要症状 有恶心、呕吐、头痛、头晕、腹痛、腹泻等，部分病人还有全身乏力、步伐不稳 等似酒醉样症状。现有单端孢霉烯族毒素及相应真菌的检测方法多为物理化学方法，如薄层色谱 法、高效液相色谱法、气相色谱法、萤光、比色等，也有一些生物检测法及免疫 检测法，但这些方法的成本都比较高，目前尚未见用环介导等温扩增方法检测单 端孢霉烯族毒素及相应真菌的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种产单端孢霉烯族毒素真菌环介导等温扩增快速检测 方法，以弥补现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。本专利技术的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个 内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)， 内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随 后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启 动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动 的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA; (3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环 DNA; (4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有耙 DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过 荧光染料来观察扩增结果。本专利技术涉及的中，包 括的试剂如下(1) - (4):(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液 其中包括10XThermopol反应缓冲液、1.0 — 1.4 mmol/L dNTP、 4—8mmol/L 硫酸镁(MgS04)、 0.8—1.6iJmol/L上游引内物(FIP)、 0. 8 — 1. 6ymol/L下游内引 物(BIP)、 0.2—0.3pmol/L上游外引物(F3)、 0. 2—0. 3pmol/L下游外引物(B3) 和l一1.5mol/L甜菜碱； 上游内引物5國AGACTGTGGCCGACTTGCAAC-CTTCCCACCTTCACACGG -3、下游内引物5-TGAAAGCGGACGGGACTTTAGG-GGCATTCTGAGTAGCGACAG-3、 上游外引物5-GCCAAGCCAGCTTATCGC-3 、 下游外引物5-CAGGTCTTGAGCTGACTGAG-3 、其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP 二2:1:1:1。其中所述的10XThermopol反应缓冲液中含有200 mmol pH8.8的三羟基甲基氨 基甲垸一盐酸(Tris—HCl)、 100mmol/L氯化钾(KC1)、 100 mmol/L硫酸铵((NH4) 2S04)、 20 mmol/L硫酸镁(MgS04)和1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) 腦酶1 U/|JL;(3) Bst DNA聚合酶8 U /pL;(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管共有22IJL，其最佳组成为2. 5pL10XThermopol反应缓冲液、1. 4jjL 25mraol/L dNTP (四种脱氧核糖核酸的混合物)、 4.0|jL KHJmol/L上游内引物(FIP)、 4. 0|JL 10jjmol/L下游内引物(BIP)、 0. 5pL 10pmol/L上游外引物(F3)、 0. 5|JL 10Mmol/L下游外引物(B3)、 2|jL 100 ramol/L MgS04、 5|jL 5M甜菜碱和2. lyL ddH20 (灭菌双蒸水)。使用上述方法检测产单端孢霉烯族毒素真菌，依次包括下列步骤(1) - (3): (1)待检样品或真菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D26。/0D28。在1.6-2.0范围内，浓度 在10-100 ng/ijL范围内。(2) 进行产单端孢霉烯族毒素真菌的环介导等温扩增反应A. 在装有22ijL LAMP反应液的反应管中加入2yL待检模板DNA，禾卩O. 5yL的UNG 酶，于恒温水浴上50。C放置3 min， 95。C放置3—5 min，立即置于冰上l一3 min;B. 在各反应管中加入llJL Bst DNA聚合酶，并于水浴锅中恒温水浴上60 — 65 。C扩增反应45—90 min;C. 将水浴调到80—85。C终止反应，3—5min后取出待检；(3) 显色检测在待检的每个反应管中加入lpL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜 色变为绿色，说明待检样品含有或为产单端孢霉烯族毒素真菌。本专利技术是根据产单端孢霉烯族毒素真菌tri6基因的六个序列设计了两个特异 性内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为产单端孢霉烯族毒素真菌各不 同菌株型所共有，以保证检测不同来源的产单端孢霉烯族毒素真菌的可靠性。本 专利技术采用环介导等温扩增技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏 度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法 来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，特别适用于基层医疗机构。 具体实施例方式下列实施例进一步说明本专利技术，但不应当作对本专利技术的限制。 实施例l按下列配方制作产单端孢霉烯族毒素真菌的环介导等温扩增反应液 (1) LAMP反应液含有2. 5|JL 10XThermopol反应缓冲液、1. 4pL 25mmol/L dNTP (四种脱氧核 糖核酸的混合物)、4.0|JL 10)jmol/L上游内引物(FIP)、 4. 0|jL 10iJmol/L下游内引 物(BIP)、 0.5|jl 1(Hmo1/L上游外引物(F3)、 0. 5|jL 10jjmol/l下游外引物(B3)、 2|JL 100 mmol/L MgS04、 5|JL 5M甜菜碱和2. l|jL ddH20 (灭菌双蒸水)。其中所述的上游内本文档来自技高网...
【技术保护点】
环介导等温扩增检测产单端孢霉烯族毒素真菌的试剂，其特征是该试剂包括（１）－（４）： （１）环介导等温扩增反应液： 包括１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反应缓冲液、１．０－１．４ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ、４－８ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁（ＭｇＳＯ４）、０．８－１．６μｍｏｌ／Ｌ上游引内物（ＦＩＰ）、０．８－１．６μｍｏｌ／Ｌ下游内引物（ＢＩＰ）、０．２－０．３μｍｏｌ／Ｌ上游外引物（Ｆ３）、０．２－０．３μｍｏｌ／Ｌ下游外引物（Ｂ３）和１－１．５ｍｏｌ／Ｌ甜菜碱；其中１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反应缓冲液含有２００ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ８．８的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、１００ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸铵、２０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁和１％曲拉通Ｘ－１００； 其中上游内引物： ５－ＡＧＡＣＴＧＴＧＧＣＣＧＡＣＴＴＧＣＡＡＣ－ＣＴＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＡＣＧＧ－３； 下游内引物： ５－ＴＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＴＴＴＡＧＧ－ＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＧＴＡＧＣＧＡＣＡＧ－３； 上游外引物：５－ＧＣＣＡＡＧＣＣＡＧＣＴＴＡＴＣＧＣ－３； 下游外引物：５－ＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＧＣＴＧＡＣＴＧＡＧ－３； （２）ＵＮＧ酶：１Ｕ／μＬ； （３）Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶：８Ｕ／μＬ； （４）显色剂：为１０％的荧光染料ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉ或者ＤＮＡＧｒｅｅｎ。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：雷质文，贺楠，唐静，刘云国，李正义，房保海，祝素珍，贾俊涛，赵丽青，马维兴，张健，姜英辉，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
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