肉毒梭菌环介导等温扩增快速检测方法技术

本发明专利技术涉及一种肉毒梭菌环介导等温扩增快速检测方法。其中的试剂包括环介导等温扩增反应液、Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶、显色剂；环介导等温扩增反应液含有反应缓冲液、ｄＮＴＰ、硫酸镁、上游内引物５－ＧＡＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＴＡ－ＡＧＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＧ－３、下游内引物５－ＧＣＣＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡ－ＧＴＡＧＣＡＡＡＴＴＴＧＣＣＴＧＣＡ－３、上游外引物５－ＡＧＴＡＡＴＡＡＴＡＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣ－３、下游外引物５－ＴＣＡＴＧＴＧＣＴＡＡＴＧＴＴＡＣＴＧＣ－３和甜菜碱；检测Ａ型肉毒梭菌的方法包括细菌ＤＮＡ的提取、肉毒梭菌Ａ型的环介导等温扩增和显色检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方 法，具体是一种A型。
技术介绍
肉毒梭菌(Clostridium botulinum)属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，具有该菌的 基本特性，即厌氧性的杆状菌，形成芽胞，芽胞比繁殖体宽，呈梭状，革兰氏染 色为阳性，产生剧烈细菌外毒素，即肉毒毒素。肉毒毒素能引起人和动物的肉毒 中毒，根据肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、 B、 C (1、 2)、 D、 E、 F、 G 七个型。引起人群中毒的，主要有A、 B、 E三型；C、 D二型毒素主要是畜、禽肉毒 中毒的病原；F、 G型肉毒梭菌极少分离，未见G型菌引起人群的中毒报道。肉毒梭 菌广泛存在于自然界，引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品等。 在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，在我国主要以发酵食品为主， 如臭豆腐、豆瓣酱、面酱、豆豉等，其它也引起中毒的食品还有熏制未去内脏 的鱼、填馅茄子、油浸大蒜、烤土豆、炒洋葱、蜂蜜制品等。肉毒梭菌是致死性 最高的病原体之一，感染剂量极低，每个人都易感。摄食18-36小时后发病为典型 病症，但不典型的可在4小时至8天不等，症状为虚弱、眩晕、伴随视觉成双、渐 进性说话障碍、呼吸和吞咽困难，最终引起麻痹、死亡。据统计，1899年至1990 年，在美国共有2305人中毒，经检测，303人感染A型毒素，92人感染B型毒，3人 感染E型毒素，2人感染F型毒素，有2起中毒事件是由A、 B二种毒素引起。而在我 国，各地发生的肉毒中毒事件也主要是A型和B型。现有肉毒梭菌及肉毒毒素的检测方法有血清学实验、小白鼠腹腔注射及中和试 验、ELISA多用双抗体夹心法、PCR方法等，这些方法各有优势，但也有不足，或所需时间过长、或步骤繁琐、或成本较高。而环介导等温扩增方法方便、快速、 成本低，适于现场检测，有较好的应用性，目前尚未见用环介导等温扩增方法检 测肉毒梭菌的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种A型肉毒梭菌环介导等温核酸扩增方法，以克服现有 技术的缺点，从而为水产养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。本专利技术的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个 内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和耙DNA杂交，随 后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由 一个外弓I物启 动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动 的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA; (3)内引物以原始茎环DNA做模板，启 动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环 DNA; (4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有耙 DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过 荧光染料来观察扩增结果。本专利技术涉及的A型中，其中包括的试剂 如下(1) - (4):(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液 其中包括10XThermopol反应缓冲液、1.0 — 1.4 mmol/L dNTP、 4一8mmol/L 硫酸镁(MgS04)、 0.8 —1.6nmol/L上游引内物(FIP)、 0. 8 — 1. 6iJmol/L下游内引 物(BIP)、 0.2—0. 3nmol/L上游外引物(F3)、 0. 2—0. 3iJmol/L下游外引物(B3) 和l一1.5mol/L甜菜碱；上游内引物5- GAGCCATAACCATTTCGCGTA-AGTTTGAATGTAAAAGCTTTGG -3、下游内引物5-GCCCAGATTTTACATTTGGTTTTGA-GTAGCAAATTTGCCTGCA -3 、 上游外引物5-AGTAATAATAGGACCCTCAGC-3 、 下游外引物5-TCATGTGCTAATGTTACTGC-3 、其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP 二2:1:1:1。其中所述的10XThermopol反应缓冲液中含有200 mmol pH8.8的三羟基甲基氨 基甲烷一盐酸(Tris—HCl)、 100咖ol/L氯化钾(KC1)、 100 mmol/L硫酸铵((NHJ 2S04)、 20咖ol/L硫酸镁(MgS04)和1^曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) 跳酶1 U/pL;(3) Bst DNA聚合酶8 U /yL;(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述环介导等温扩增反应液每管共有22iJL，其最佳组成为2.5JJL 10 XThermopol反应缓冲液、1. 4|jL 25mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、4. 0|jL 10nmol/L上游内引物(FIP)、 4.0ijLl(Hjmol/L下游内引物(BIP)、 0. 5pL 10|jmol/L 上游外引物(F3)、 0.5pL10iJniol/L下游外引物(B3)、 2|jL 100 mmol/L MgS04、 5jjL5M甜菜碱和2. 1|JL ddH20 (灭菌双蒸水)。使用上述试剂检测A型肉毒梭菌的方法，依次包括下列步骤(1) - (3):(1) 待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D26。/0D28。在1.6-2.0范围内，浓度 在IO-IOO ng/ijL范围内;(2) 进行A型肉毒梭菌的环介导等温扩增反应A. 在装有22jjL LAMP反应液的反应管中加入2pL待检模板DNA,和O. 5ijL的UNG 酶，于恒温水浴上5(TC放置3 min， 95。C放置3—5 min，立即置于冰上1一3 min;B. 在反应管中加入lpL Bst DNA聚合酶，并于水浴锅中恒温水浴上60—65。C 扩增反应45—90 min;C. 将水浴调到80—85"C终止反应，3—5min后取出待检；(3) 显色检测在待检的每个反应管中加入lpL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜 色变为绿色，说明待检样品含有或为A型肉毒梭菌。本专利技术是根据A型肉毒梭菌保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个 特异性外引物，该保守基因序列为A型肉毒梭菌所共有，以保证检测不同来源的A 型肉毒梭菌的可靠性。本专利技术采用环介导等温扩增技术，该技术特异性强，与PCR 检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且 结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，特别 适用于基层医疗机构。 具体实施例方式下列实施例进一步说明本专利技术，但不应当作对本专利技术的限制。 实施例l按下列配方制作A型肉毒梭菌的环介导等温扩增反应液(1) LAMP反应液含有2. 5pL 10XThermopol反应缓冲液、1. 4pL 25mmol/L dNTP (四种脱氧核 糖核酸的混合物)、4.0|JL 10iJmol/L上游内引物(FIP)、 4. 0yL 10ymol/L下游内引 物(BIP本文档来自技高网...

【技术保护点】
环介导等温扩增检测肉毒梭菌的试剂，其特征是该试剂包括（１）－（４）：　（１）环介导等温扩增反应液：　包括１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反应缓冲液、１．０－１．４ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ、４－８ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁（ＭｇＳＯ４）、０．８－１．６μｍｏｌ／Ｌ上游引内物（ＦＩＰ）、０．８－１．６μｍｏｌ／Ｌ下游内引物（ＢＩＰ）、０．２－０．３μｍｏｌ／Ｌ上游外引物（Ｆ３）、０．２－０．３μｍｏｌ／Ｌ下游外引物（Ｂ３）和１－１．５ｍｏｌ／Ｌ甜菜碱；其中１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反应缓冲液含有２００ｍｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ８．８的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、１００ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸铵、２０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁和１％曲拉通Ｘ－１００；　其中，上游内引物：　５－ＧＡＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＴＴＴＣＧＣＧＴＡ－ＡＧＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＧ－３；　下游内引物：　５－ＧＣＣＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡ－ＧＴＡＧＣＡＡＡＴＴＴＧＣＣＴＧＣＡ－３；　上游外引物：５－ＡＧＴＡＡＴＡＡＴＡＧＧＡＣＣＣＴＣＡＧＣ－３；　下游外引物：５－ＴＣＡＴＧＴＧＣＴＡＡＴＧＴＴＡＣＴＧＣ－３；　（２）ＵＮＧ酶：１Ｕ／μＬ；　（３）Ｂｓｔ　ＤＮＡ聚合酶：８Ｕ／μＬ；　（４）显色剂：为１０％的荧光染料ＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ　Ｉ或者ＤＮＡＧｒｅｅｎ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：雷质文，贺楠，祝素珍，贾俊涛，刘云国，张健，姜英辉，李正义，房保海，唐静，赵丽青，马维兴，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]