涉及突变体难辨梭菌毒素的组合物及其方法技术

在一方面，本发明专利技术涉及免疫原性组合物，其包含突变体难辨梭菌毒素A和/或突变体难辨梭菌毒素B。相对于相应的野生型难辨梭菌毒素，每种突变体毒素包括具有至少一个突变的葡萄糖基转移酶结构域和具有至少一个突变的半胱氨酸蛋白酶结构域。所述突变体毒素还可包含至少一个经化学交联的氨基酸。在另一方面，本发明专利技术涉及结合所述免疫原性组合物的抗体或其结合片段。在另外的方面，本发明专利技术涉及编码任意前述物质的分离的核苷酸序列，以及使用任意前述组合物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】涉及突变体难辨梭菌毒素的组合物及其方法相关申请的交叉参考本申请要求2011年4月22日提交的U.S.ProvisionalPatentApplication61/478,474、和2011年4月25日提交的U.S.ProvisionalPatentApplication61/478,899的优先权。上述申请的全部内容以其整体援引加入本文。专利
本专利技术针对的是涉及突变体难辨梭菌(Clostridiumdifficile)毒素的组合物及其方法。专利技术背景难辨梭菌(C.difficile)是革兰氏阳性的厌氧菌，其与人类胃肠道疾病相关。如果天然肠菌群由于用抗体治疗而减少，则难辨梭菌的建群通常在结肠中发生。通过葡萄糖基化毒素，毒素A和毒素B(分别为308和270kDa，其是难辨梭菌的主要毒力因子)的分泌，感染可导致抗生素相关性腹泻以及有时导致假膜性结肠炎。毒素A和毒素B分别是由基因tcdA和tcdB在19kb的致病性基因座(PaLoc)内所编码的。难辨梭菌的非致病性菌株中此基因座被另外的115碱基对的序列所置换。毒素A和毒素B均为强力细胞毒素。这些蛋白是使Rho/Rac/Ras家族的小GTPase失活的同源葡萄糖基转移酶。所导致的信号传导中断会引起细胞-细胞连接、肌动蛋白细胞骨架失调、和/或凋亡的丧失，导致与难辨梭菌感染(CDI)相关的深层分泌性腹泻(profoundsecretorydiarrhea)。在最近十年，在医院、疗养院、和其它长期护理机构中难辨梭菌爆发的次数和严重性大幅增加。此增加的主要因素包括高毒性致病菌株的出现、抗生素使用的增加、检测方法的改善、和健康护理机构中对空气散播孢子暴露的增加。甲硝唑和万古霉素是目前接受的用于难辨梭菌相关疾病(CDAD)抗生素治疗的护理标准。然而，大约20%接受此种治疗的患者在第一期CDI之后经历感染的复发，以及达到大约50%的那些患者患有另外的复发。复发的治疗是非常重要的挑战，大部分的复发通常在前一期的一个月之内发生。因此，需要涉及难辨梭菌的免疫原性和/或治疗性组合物以及其方法。专利技术概述本专利技术在本文中提供了这些以及其它的目标。在一方面，本专利技术涉及免疫原性组合物，其包括突变体难辨梭菌毒素A。相对于相应的野生型难辨梭菌毒素A，所述突变体难辨梭菌毒素A包括具有至少一个突变的葡萄糖基转移酶结构域和具有至少一个突变的半胱氨酸蛋白酶结构域。在一个实施方案中，所述突变体难辨梭菌毒素A的至少一个氨基酸是经化学交联的。在一方面，本专利技术涉及包括SEQIDNO:4所示氨基酸序列的分离的多肽，其中位置1处的甲硫氨酸残基任选不存在，并且其中所述多肽包括至少一个经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学修饰的氨基酸侧链。在一个实施方案中，所述突变体难辨梭菌毒素的至少一个氨基酸是经化学交联的。在一个实施方案中，所述至少一个氨基酸氨基酸是经如下化学交联的:甲醛，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)，N-羟基琥珀酸酯/盐，或者EDC和NHS的组合。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物由各自的抗毒素中和抗体或其结合片段所识别在一个实施方案中，相对于相应的野生型难辨梭菌毒素，所述免疫原性组合物展现降低的细胞毒性。在另一方面，本专利技术涉及免疫原性组合物，其包括突变体难辨梭菌毒素A，所述突变体难辨梭菌毒素A包括具有SEQIDNO:29的葡萄糖基转移酶结构域，其在位置285和287具有氨基酸取代(相对于相应的野生型难辨梭菌毒素A)，以及具有SEQIDNO:32的半胱氨酸蛋白酶结构域，其在位置158具有氨基酸取代(相对于相应的野生型难辨梭菌毒素A)，其中所述突变体难辨梭菌毒素A的至少一个氨基酸是经化学交联的。在另外的方面，本专利技术涉及包括突变体难辨梭菌毒素A的免疫原性组合物，所述突变体难辨梭菌毒素A包括SEQIDNO:4，其中所述突变体难辨梭菌毒素A的至少一个氨基酸是经化学交联的。在另一方面，本专利技术涉及免疫原性组合物，其包括SEQIDNO:4，SEQIDNO:5，SEQIDNO:6，SEQIDNO:7，或SEQIDNO:8。在一方面，本专利技术涉及包括突变体难辨梭菌毒素B的免疫原性组合物。相对于相应的野生型难辨梭菌毒素B，所述突变体难辨梭菌毒素B包括具有至少一个突变的葡萄糖基转移酶结构域和具有至少一个突变的半胱氨酸蛋白酶结构域。在另一方面，本专利技术涉及包括SEQIDNO:6所示氨基酸序列的分离的多肽，其中位置1处的甲硫氨酸残基任选不存在，并且其中所述多肽包括至少一个经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学修饰的氨基酸侧链。在另一方面，本专利技术涉及包括突变体难辨梭菌毒素B的免疫原性组合物，所述突变体难辨梭菌毒素B包括具有SEQIDNO:31的葡萄糖基转移酶结构域，其在位置286和288具有氨基酸取代(相对于相应的野生型难辨梭菌毒素B)，和具有SEQIDNO:33的半胱氨酸蛋白酶结构域，其在位置155具有氨基酸取代(相对于相应的野生型难辨梭菌毒素B)，其中所述突变体难辨梭菌毒素B的至少一个氨基酸是经化学交联的。在另外的方面，本专利技术涉及包括突变体难辨梭菌毒素B的免疫原性组合物，所述突变体难辨梭菌毒素B包括SEQIDNO:6，其中所述突变体难辨梭菌毒素B的至少一个氨基酸是经化学交联的。在一方面，本专利技术涉及包括突变体难辨梭菌毒素A和突变体难辨梭菌毒素B的免疫原性组合物，所述突变体难辨梭菌毒素A包括SEQIDNO:4，所述突变体难辨梭菌毒素B包括SEQIDNO:6，其中每个所述突变体难辨梭菌毒素的至少一个氨基酸是经化学交联的。在另外的方面，本专利技术涉及包括多核苷酸的重组细胞或其后代，所述多核苷酸编码任意前述突变体难辨梭菌毒素，其中所述细胞缺乏编码毒素的内源多核苷酸。在另一方面，本专利技术涉及抗体或其抗体结合片段，其特异于包括突变体难辨梭菌毒素的免疫原性组合物。在一方面，本专利技术涉及在哺乳动物中治疗难辨梭菌感染的方法。所述方法包括向哺乳动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括突变体难辨梭菌毒素A和突变体难辨梭菌毒素B，所述突变体难辨梭菌毒素A包括SEQIDNO:4，所述突变体难辨梭菌毒素B包括SEQIDNO:6，其中每个所述突变体难辨梭菌毒素的至少一个氨基酸是经甲醛交联的。在一方面，本专利技术涉及在哺乳动物中治疗难辨梭菌感染的方法。所述方法包括向哺乳动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括突变体难辨梭菌毒素A和突变体难辨梭菌毒素B，所述突变体难辨梭菌毒素A包括SEQIDNO:4，所述突变体难辨梭菌毒素B包括SEQIDNO:6，其中每个所述突变体难辨梭菌毒素的至少一个氨基酸是经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和/或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联的。在一方面，本专利技术涉及在哺乳动物中诱导对难辨梭菌感染免疫应答的方法。所述方法包括向哺乳动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括突变体难辨梭菌毒素A和突变体难辨梭菌毒素B，所述突变体难辨梭菌毒素A包括SEQIDNO:4，所述突变体难辨梭菌毒素B包括SEQIDNO:6，其中每个所述突变体难辨梭菌毒素的至少一个氨基酸是经甲醛交联的。在一方面，本专利技术涉及在哺乳动本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含SEQ?ID?NO:4所示氨基酸序列的分离的多肽,其中位置1处的甲硫氨酸残基任选不存在,并且其中所述多肽包含至少一个经1?乙基?3?(3?二甲基氨丙基)碳二亚胺)(EDC)和N?羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学修饰的氨基酸侧链。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.04.22 US 61/478,474;2011.04.25 US 61/478,8991.分离的多肽，其由突变体难辨梭菌(C.difficile)毒素A的氨基酸序列组成，所述突变体难辨梭菌毒素A的氨基酸序列与SEQIDNO:1相比在位置285、287和700处具有突变D285A、D287A和C700A，其中位置1处的甲硫氨酸缺失。2.权利要求1的分离的多肽，其由SEQIDNO:4所示氨基酸序列组成，其中位置1处的甲硫氨酸残基任选不存在。3.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽的至少一个赖氨酸残基的侧链连接至β-丙氨酸部分。4.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽的第二赖氨酸残基的侧链连接至天冬氨酸残基的侧链和/或连接至谷氨酸残基的侧链。5.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽的至少一个天冬氨酸残基的侧链和/或至少一个谷氨酸残基的侧链连接至甘氨酸部分。6.权利要求1的分离的多肽，其中通过体外细胞毒性测定，所述分离的多肽具有至少约100μg/ml的EC50值。7.权利要求1的分离的多肽，其中通过体外细胞毒性测定，所述分离的多肽具有至少约1000μg/ml的EC50值。8.免疫原性组合物，其包含由突变体难辨梭菌毒素A的氨基酸序列组成的第一个分离的多肽，所述突变体难辨梭菌毒素A的氨基酸序列与SEQIDNO:1相比在位置285、287和700处具有突变D285A、D287A和C700A，其中位置1处的甲硫氨酸缺失。9.权利要求8的免疫原性组合物，其中所述分离的多肽的至少一个氨基酸是化学交联的。10.权利要求8或9的免疫原性组合物，其中相对于相应的野生型难辨梭菌毒素A，所述组合物展现出降低的细胞毒性。11.权利要求8的免疫原性组合物，其还包含具有缺失了第1位甲硫氨酸的SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的第二个分离的多肽。12.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述第二个分离的多肽由SEQIDNO:6组成。13.权利要求12的免疫原性组合物，其中位置1处的甲硫氨酸残基任选缺失。14.权利要求11的免疫原性组合物，所述第一个分离的多肽由SEQIDNO:4所示氨基酸序列组成，其中位置1处的甲硫氨酸残基任选不存在，并且所述第二个分离的多肽由SEQIDNO:6所示氨基酸序列组成。15.权利要求8或11的免疫原性组合物，其中所述多肽的至少一个赖氨酸残基的侧链连接至β-丙氨酸部分。16.权利要求8的免疫原性组合物，其中所述第一个分离的多肽的第二赖氨酸残基的侧链连接至天冬氨酸残基的侧链和/或连接至谷氨酸残基的侧链。17.权利要求8的免疫原性组合物，其中所述第一个分离的多肽的至少一个天冬氨酸残基的侧链和/或至少一个谷氨酸残基的侧链连接至甘氨酸部分。18.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述第二个分离的多肽的第二赖氨酸残基的侧链连接至天冬氨酸残基的侧链和/或连接至谷氨酸残基的侧链。19.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述第二个分离的多肽的至少一个天冬氨酸残基的侧链和/或至少一个谷氨酸残基的侧链连接至甘氨酸部分。20.权利要求8或11的免疫原性组合物，其中通过体外细胞毒性测定，所述分离的多肽具有至少约100μg/ml的EC50值。21.权利要求8或11的免疫原性组合物，其中通过体外细胞毒性测定，所述分离的多肽具有至少约1000μg/ml的EC50值。22.权利要求8的免疫原性组合物，其中所述组合物还包含佐剂。23.权利要求22的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含铝。24.权利要求22的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含氢氧化铝凝胶和CpG寡核苷酸。25.权利要求22的免疫原性组合物，其中所述佐剂包含26.权利要求8的免疫原性组合物，其中所述多肽包含所述多肽的赖氨酸残基侧链和所述多肽的天冬氨酸残基侧链之间的至少一个交联；和所述多肽的赖氨酸残基侧链和所述多肽的谷氨酸残基侧链之间的至少一个交联。27.权利要求11的免疫原性组合物，其中所述第二个分离的多肽包含所述第二个分离的多肽的赖氨酸残基侧链和所述第二个分离的多肽的天冬氨酸残基侧链之间的至少一个交联；和所述第二个分离的多肽的赖氨酸残基侧链和所述第二个分离的多肽的谷氨酸残基侧链之间的至少一个交联。28.权利要求8的免疫原性组合物，其还包含缓冲剂。29.权利要求8的免疫原性组合物，其还包含稳定剂。30.权利要求8的免疫原性组合物，其还包含表面活性剂。31.权利要求8的免疫原性组合物，其还包含polysorbate80。32.权利要求8的免疫原性组合...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·K·希胡，A·S·安德森，R·G·K·唐纳德，K·U·扬森，N·K·卡利安，T·L·米宁尼，J·K·莫兰，M·E·鲁彭，M·J·弗林特，
申请(专利权)人：惠氏有限责任公司，
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