一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种用于检测艰难梭菌Ａ、Ｂ毒素的快速检测试纸条。它是在硝酸纤维膜（ＮＣ膜）上包被艰难梭菌Ａ毒素的单克隆抗体或多抗、艰难梭菌Ｂ毒素的单克隆抗体或多抗和质控二抗ＩｇＧ，结合胶体金标记的艰难梭菌Ａ、Ｂ毒素的单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法，检测标本中艰难梭菌Ａ、Ｂ毒素。应用本发明专利技术试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和流行病学调查，对艰难梭菌感染诊断起到辅助作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种艰难梭菌A、 B毒素胶 体金检测试纸条、其制备方法及其应用。
技术介绍
艰难梭菌(Clostridium difficile)属厌氧性细菌，是梭菌属的 一个 成员。梭菌属可分为几个群，其中几个对人具有致病性的，最著名的 有产气荚膜梭菌、破伤风梭菌和肉毒梭菌。艰难梭菌是造成抗生素相 关腹泻及伪膜性结肠炎的病原菌。艰难梭菌芽孢菌的细菌平时寄生在人类肠道中。如果过量服用抗 生素致使菌群增长速度过快，就会引发严重的炎症。该菌能引起伪膜 性肠炎，90~95%的伪膜性肠炎患者粪便中能检出本菌。涂片染色可 见粗大革兰氏阳性杆菌，位于菌体近端至颈端可见呈卵圆形芽胞，可 结合临床作出早期诊断。艰难梭菌的一种流行菌株产生高水平的A、 B毒素，毒素A有肠毒性，毒素B有细胞毒性。毒素A也有一定的细胞 毒性作用，但比毒素B小。毒素A和B是艰难梭菌的主要致病因子，可 干扰肠道上皮细胞的肌动蛋白骨架，使细胞丧失功能。目前实验室检 验可帮助诊断艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)。由艰难梭菌引发的医院内感染日益被人们重视，艰难梭菌产毒株 的快速诊断、鉴定对确定病源、防止及控制医院内感染的传播和有 效治疗极其重要。组织培养的方法检测艰难梭菌的产毒株，需要特 殊的组织培养条件，操作繁瑣复杂，且检测周期长，用于院内感染的 监控难以普及。釆用免疫学方法检测艰难梭菌毒素A&B则逐渐得以 应用。艰难梭菌感染的临床表现轻重不一，且无特异性，诊断主要依赖 于辅助检查，方法很多，各自的敏感性和特异性相差较大。艰难梭菌的分离培养一般用环丝氨酸-甲氧头孢噻嗪-果糖-琼脂(CCFA)选择培 养基，其敏感性和特异性分别为97%和93%;细胞培养法测定细胞毒 素的敏感性和特异性分别为67%和99%。免疫学测定毒素的方法(如 放免、乳凝、ELISA等)敏感性和特异性在68。/。和95。/。左右。前两种方 法费时，耗物，但准确可靠，后者简便快速可用于筛选。近年有文献 报道用基因探针方法检测艰难梭菌感染，其敏感性和特异性有待进一 步评价。此外，对于重症病人及时行纤维肠镜检查，常可发现特异性 的伪膜，具有确诊意义。但通常认为艰难梭菌诊断以毒素检测和培养细胞的毒素中和试 验为"金标准"。产毒素培养是检测艰难梭菌分离菌株的毒素产生情 况，并具有较高的敏感性和相当的特异性。通常肠毒素的检测釆用琼 脂双扩散法、ELISA法、家兔肠管结扎试验、反向间接血球凝集试验、 小鼠致死试验、豚鼠皮肤试验等，而直接粪便标本毒素验中和实验， 在已确诊的CDAD患者中，会有15~38%检测不到毒素。但以上方法 均存在需专业人员在特定的实验室，需要一定的设备和仪器，操作繁 瑣，时间长等缺点。胶体金免疫层析法(Immunochromatography Assay)始于上世纪 90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的。它是免疫亲和技 术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗原、胶体 金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析 诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就可 以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且 由于为试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测艰难梭菌A、 B毒素的试纸条，检测人类粪便中艰难梭菌A、 B毒素，用于艰难梭菌感染的辅助诊断。本专利技术的另一目的是提供一种艰难梭菌A、 B毒素胶体金检测试纸条的制备方法。本专利技术的再一目的是提供一种艰难梭菌A、 B毒素胶体金检测试纸条的应用。本专利技术提供了一种艰难梭菌A、 B毒素胶体金检测试纸条，其包 含同时包被艰难梭菌A毒素的单克隆抗体或多克隆抗体、抗艰难 梭菌B毒素的单克隆抗体或多克隆抗体和二抗IgG三个条带的硝酸 纤维膜；及含有胶体金标记的艰难梭菌A、 B毒素的单克隆抗体的玻 璃纤维膜。其中，所述艰难梭菌A毒素的单克隆抗体的位点特异性的针对A 毒素羧基端320个氨基酸的功能区。所述艰难梭菌B毒素单克隆抗体的位点特异性的针对B毒素羧基 端的615个氨基酸的抗原区CDB3。艰难梭菌A、 B毒素的单克隆抗体或抗艰难梭菌A、 B毒素特异 性抗原的多克隆抗体是用原核表达的基因工程抗原免疫Bab/c纯系小 鼠制备获得。所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。所述艰难梭菌A毒素的单克隆抗体或多克隆抗体的包被浓度为 1.2±0.2mg/ml,抗艰难梭菌B毒素的单克隆抗体或多克隆抗体的包被 浓度为1.5±0.1mg/ml。所述抗鼠IgG抗体的浓度为2±0.2mg/ml。所述玻璃纤维膜中胶体标记的艰难梭菌A、 B毒素的单克隆抗体 的pH值为7.6~8.0，胶体金和抗体的配比为以18 24吗/ml胶体金加 入艰难梭菌A、 B毒素的单克隆抗体。本专利技术所述艰难梭菌A、 B毒素胶体金检测试纸条，还包括反应 支持物、金标抗体保护膜和吸水垫，所述反应支持物上依次相互搭接粘贴的金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。反应支持物优选PVC板；吸水垫优选滤油纸；金标抗体保护膜 同时具有吸水功能，优选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。本专利技术所述的艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条的制备方法，包括如下步骤1) 制备艰难梭菌A、 B毒素的单克隆抗体或抗艰难梭菌A、 B 毒素特异性抗原的多克隆抗体；2) 硝酸纤维膜的制备艰难梭菌A毒素的单克隆抗体或多克隆抗 体的包被浓度为1.2士0.2mg/ml，抗艰难梭菌B毒素的单克隆抗体或多 克隆抗体的包被浓度为1.5±0.1mg/ml，抗鼠IgG抗体包被浓度为 2±0.2mg/ml,喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37 r中干燥2小时，备用；3)玻璃纤维膜的制备艰难梭菌A、 B毒素的单克隆抗体标记 胶体金调整抗体pH值为7.6 8.0,以18 24ng/ml胶体金加入艰难梭菌 A、 B毒素的单克隆抗体，经稳定剂(含0.05。/。BSA， pH8.0， O.OlMTris 缓冲液)处理后，按每平方厘米65ul的量均匀吸附于玻璃纤维膜上， 冷冻干燥，备用；4)最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻 璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。本专利技术所述艰难梭菌A、 B毒素胶体金检测试纸条在检测艰难梭 菌A、 B毒素中的应用。本专利技术釆用纯化的艰难梭菌A、 B毒素的单克隆抗体或抗艰难梭 菌A、B毒素的多克隆抗体和抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上(NC 膜)，结合胶体金标记的艰难梭菌A、 B毒素的单克隆抗体，应用膜 层析双抗体夹心法的原理检测标本中的艰难梭菌A、 B毒素。本专利技术的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定 性半定量检测样本中可能存在的艰难梭菌A、 B毒素，达到快速條检病人，及时控制疫情的目的。节省了大量人力物力，方便、快速、简 捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单， 易于推广，适合基层，适合于现场检测和流行病学调查，对艰难梭菌 的感染诊断起到辅助作用。附图说明图1A为本专利技术艰难梭菌A、 B毒素试纸条的正面示意图； 图1B为本专利技术艰难梭菌A、 B毒素试纸条的侧面示意图； 其中，1:吸水垫 2:硝酸纤维膜(T1:艰难梭菌A毒素的单本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种艰难梭菌Ａ、Ｂ毒素检测试纸条，其特征在于，其包含：同时包被艰难梭菌Ａ、Ｂ毒素的单克隆抗体或抗艰难梭菌Ａ、Ｂ毒素特异性抗原的多克隆抗体和二抗ＩｇＧ三个条带的硝酸纤维膜（２）；及含有胶体金标记的艰难梭菌Ａ、Ｂ毒素的单克隆抗体的玻璃纤维膜（３）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明，
申请(专利权)人：北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]