本发明专利技术提供了一种用于检测空肠弯曲菌特异性抗原的快速检测试纸条，包括反应膜和结合物释放垫，所述反应膜具有包被权利要求１所述单克隆抗体或ＰＥＢ１多克隆抗体的检测带和包被二抗ＩｇＧ的质控带；所述结合物释放垫包被胶体金标记的与反应膜上不同抗原结合位点的ＰＥＢ１单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法，检测标本中空肠弯曲菌的特异性抗原。应用本发明专利技术试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于突发事件的大批量现场检测，适合流行病学调查，对空肠弯曲菌的感染诊断起到辅助作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，涉及空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1基因 工程抗原的制备及其单克隆抗体的研制，和含有该单克隆抗体的空肠 弯曲菌胶体金快速检测试纸条及其应用。
技术介绍
空肠弯曲菌病是由空肠弯曲菌(Cjejuni)引起的感染性疾病。空肠 弯曲菌引起的肠炎是世界性疾病，在经济发达国家，是主要的食源性 感染性疾病，空肠弯曲菌感染引起的腹泻在细菌性腹泻病中位居榜 首。在发展中国家，腹泻病发病率较高，空肠弯曲菌引起的腹泻仅次 于大肠杆菌和志贺菌。空肠弯曲菌的感染多为散发，较少有暴发，是 夏秋季腹泻的主要病原，尤其学龄前儿童发病率较高，其传染源主要 来自于污染的水和食物。最新研究证实空肠弯曲菌感染与格林-巴利 综合征(Guillain-Barre Syndrome, GBS)相关。空肠弯曲菌病是典型的 人畜共患疾病。 临床症状空肠弯曲菌感染后，临床表现复杂多样。但主要症状为腹泻性肠 炎。同时也有无症状携带和极少数因菌血症而引起的肠道外感染。 肠炎以轻、中型多见，多数可自愈。婴幼儿弯曲菌肠炎多不典型，表现为全身症状轻微，精神和外表若似无病；多数无发热和腹痛；仅 有间断性轻度腹泻，间有血便，持续较久；若合并其他肠道致病菌感 染，往往中毒症状较重、起病急。有中度发热或高热，大便多为脓血 便，6个月以下、特别是新生儿发病率最高。临床难与菌痢等区别， 应提高警惕。肠道外感染多见于老龄患者或免疫功能低下者。孕妇感 染者常见上呼吸道症状、肺炎及菌血症。可引起早产、死胎或新生儿败血症及新生儿脑膜炎。空肠弯曲菌感染目前被广泛认为是GBS的前 驱感染，GBS是目前空肠弯曲菌感染引起的主要致死因素。 临床诊断目前主要根据病史与流行特点相结合。常有不洁食物史、喝生水 及旅游史，临床症状主要为发热、腹痛、腹泻、发热多为38°C左右， 或无热；腹痛为脐周及全腹痉挛性疼痛，多伴里急后重；腹泻次数一 般不多，且可间歇性血便。确诊主要依据实验室的病原分离培养或血 清学检测结果。血清学检查血清学检查通常作为空肠弯曲菌感染的流行病学调查。发病一周 后，血清内可出现抗体，主要为lgM ，可用间接血凝试验及间接免 疫荧光试验，Western Blot等检测特异性抗体及抗体效价，正常人 或带菌者血清效价可达1:2 ~ 1:8，急性期病人抗体效价可达1 : 8~ 1 : 32 ，恢复期可达1:80- 1:320以上。由于血清抗体效价不高， 须釆取双份血清检测，以效价增高4倍作为诊断依据。空肠弯曲菌 感染后血清中IgM, IgG， IgA水平升高。IgA在感染后血清及粪便 中含量升高数周后迅速下降，对于临床诊断意义有限，但对于帮助确 定空肠弯曲菌的感染与GBS及关节炎的关系却有重要意义。病原的分离培养菌株的分离培养是空肠弯曲菌感染诊断的金标准。 其它方法目前已有多种基于免疫和基因的诊断产品应用于弯曲菌 属的诊断。包括基于酶联免疫吸附原理和应用PCR的方法直接从粪 便样品中检测病原的试剂盒。大量研究表明空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1基因序列相对保守，在 不同的血清型空肠弯曲菌中均有表达，是一种有效的保护性抗原。 PEB1由; A"基因编码，/7&"含有780bp，其中前26个氨基酸为信号 肽，成熟蛋白分子量为25.5kD 。因此属于各种空肠弯曲菌的共同抗原，可作为空肠弯曲菌的检测抗原，用于检测诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用各种空肠弯曲菌的共同抗原PEB1蛋白，研制特异性的单克隆抗体；并利用该抗原的单克隆抗体，研制一种可以 快速，准确检验布氏杆菌的空肠弯曲菌胶体金快速检测试纸。 本专利技术的另一目的在于提供上述试纸条的制备方法。 为实现上述目的，本专利技术首先利用基因工程技术，克隆并高效表达空肠弯曲菌共同抗原PEB1蛋白，并通过免疫学技术对其免疫原性 及特异性进行检定。然后，利用PEB1研制了空肠弯曲菌特异性的配 对单克隆抗体。实验表明，通过基因工程抗原制备的单克隆抗体，其 具有良好的特异性和灵敏度。进而，本专利技术提供一种试纸条，其包括反应膜和结合物释放垫， 所述反应膜具有包被抗空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1单克隆抗体或多克 隆抗体的检测带和包被二抗IgG的质控带；所述结合物释放垫包被胶 体金标记的与反应膜上不同亚型的抗空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1单克隆抗体。其中，反应膜可为硝酸纤维膜，结合物释放垫可为玻璃纤维膜。 其中，二抗IgG为抗鼠IgG抗体。本专利技术还提供 一种制备上述检测试纸条的方法，其包括如下步骤1) 按照上述方法制备单克隆抗体，或制备多克隆抗体；2) 将步骤1)制备的单克隆抗体或多克隆抗体以及二抗IgG在 反应膜上分别形成检测带和质控带，备用；3) 用胶体金标记步骤1)制备的单克隆抗体，包被到结合物释 放垫中，其中胶体金标记的单克隆抗体与步骤2)中包被在检测带中 的单克隆抗体的抗原结合位点不同；4) 将制备好的反应膜以及结合物释放垫与样本垫、吸水垫和反应支持物组装成试纸条。本专利技术空肠弯曲菌抗原快速检测试纸(胶体金法)具有以下优点:1) 检测快速IO分钟出结果；2) 特异性仅对空肠弯曲菌呈阳性，而对其他的致病菌如霍 乱霍菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、痢疾等呈阴性结果；3) 敏感性对空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1检出可达lng的水平；4) 保存和运输方便，在室温下可保存18个月；5) 便于临床和家居使用，而且具有产业性。附图说明图1:A本专利技术试纸条的正面示意图；B本专利技术试纸条的侧面 示意图。其中，1:吸水垫；2:硝酸纤维膜(T:空肠弯曲菌的单克 隆抗体或抗空肠弯曲菌的多克隆抗体的条带；C:包被抗鼠IgG的质 控条带);3:含有胶体金标记空肠弯曲菌的单克隆抗体的玻璃纤维膜; 4:金标抗体保护膜；5:反应支持物。图2:检测结果示意图。其中，从左至右依次为T、 C两条线 阳性；C一条线阴性；T、 C两条线阴性，无效。具体实施例方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的 限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。实施例1:空肠弯曲菌外膜蛋白PEB1基因工程抗原的制备CJ基因组DNA的提取取空肠弯曲菌培养物lml，离心收集细胞，然后悬浮于200ulTE液中，用基因组DNA抽提试剂盒提取DNA。 peblA基因的扩增根据Genbank(编号AL139076)报道的； e6"完整CDS，去掉氨 基端的信号肽设计一对引物，选择万"m/H和^oI作为酶切位点设计 如下引物上游为5隱GCGGATCCGCAGA AGGTAAACTTGAGTCTAT-3 ， 下游为5-CCGCTCGAGTTATAAACCCCATTTTTTCGCT-3 。 PCR扩增peblA基因。扩增条件为94"变性4min,然后94'C变 性30s， 53。C退火45s， 72。C延伸1 min,最后l个循环结束后再以 72'C延伸8min,共30个循环。所获PCR产物进行l. 5%琼脂糖凝 胶电泳鉴定，并用DNAExtractionKit试剂盒回收纯化PCR产物。 质粒pET28a(+)-peblA的构建将纯化的PCR产物和质粒pE128a(+)用B本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗空肠弯曲菌外膜蛋白ＰＥＢ１单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的由ＰＥＢ１基因工程抗原制备获得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘明，
申请(专利权)人：北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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